本发明专利技术属于微生物和生物技术领域,具体涉及一种高产5
【技术实现步骤摘要】
高产5
‑
氨基乙酰丙酸的工程菌株及5
‑
氨基乙酰丙酸高产菌株的构建方法
[0001]本专利技术属于微生物和生物
,具体涉及一种高产5
‑
氨基乙酰丙酸的大肠杆菌,以及利用该菌株生产5
‑
氨基乙酰丙酸的方法。
技术介绍
[0002]5‑
氨基乙酰丙酸 (5
‑
aminolevulinic acid,5
‑
ALA) 是生物体合成血红素、叶绿素、维生素B12等四吡咯化合物的前体,四吡咯化合物则是细胞色素、血红蛋白、叶绿体蛋白等的重要组成部分,在生命活动中发挥着重要作用。因具有可降解和无毒无残留等特点,5
‑
ALA在医药、农业、畜牧业、日用化学品等领域应用前景广阔,是一种重要的高附加值生物基化学品。5
‑
ALA作为新一代光动力学药物可用于癌症治疗、肿瘤诊断和皮肤病的治疗等;作为植物生长调节剂5
‑
ALA可以大幅促进花卉、作物和蔬菜的生长,提高作物、果品、蔬菜的品质;作为动物饲料添加剂5
‑
ALA可以增强动物的新陈代谢和免疫力。近年来,5
‑
ALA还作为主要添加成分用于化妆品以及保健食品的开发,相关产品已上市销售。
[0003]然而,目前5
‑
ALA主要通过化学合成方法制备,存在反应步骤多、转化率低、生产成本高、能耗物耗高、制备过程中使用有毒原料、环境污染严重和价格居高不下等缺点。
[0004]随着社会和科学技术的发展,以高效清洁的生物发酵法代替化学合成法生产5
‑
ALA成为人们研究的重点。目前利用微生物生产5
‑
ALA的方法主要有两类:一是对光合细菌进行诱变育种,选育高产5
‑
ALA的突变株并在特定培养基上培养,积累较高浓度的5
‑
ALA,但该方法发酵周期较长,条件控制复杂,底物和抑制剂的添加也增加了生产成本。二是利用代谢工程技术改造微生物的代谢途径,通过强化5
‑
ALA的合成使5
‑
ALA的过量积累。微生物合成5
‑
ALA的菌株主要为大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌。然而,目前微生物生产5
‑
ALA的产能较低,如大肠杆菌目前报道的最高产量为15.6 g/L(Yu, T.
‑
H., Tan, S.
‑
I., Yi, Y.
‑
C., Xue, C., Ting, W.
‑
W., Chang, J.
‑
J., Ng, I.S., 2022. New insight into the codon usage and medium optimization toward stable and high
‑
level 5
‑
aminolevulinic acid production inEscherichia coli. Biochem. Eng. J. 177, 108259.);谷氨酸棒杆菌最高产量为25.05 g/L(生产强度0.52 g/L/h,转化率16.79%)(王丽君等. 代谢改造重组谷氨酸棒杆菌C4途径高效合成5
‑
氨基乙酰丙酸. 生物工程学报,2021, 37(12)),并且发酵周期较长、糖酸转化率较低,难以满足工业化生产的要求。
[0005]综上所述,本领域急需构建更高效的工程菌株,以便提高5
‑
ALA的产量,进一步降低生产成本。
技术实现思路
[0006]针对上述需求,本专利技术通过一系列的代谢工程改造,获得高产5
‑
ALA的重组大肠杆菌。
[0007]本专利技术的目的是提供一种构建5
‑
ALA高产菌株的方法,以及利用该方法构建的5
‑
ALA高产菌株,利用该菌株生产5
‑
ALA的方法。
[0008]第一方面,提供了一种构建5
‑
ALA高产菌株的方法,其特征在于,增强菌株中5
‑
氨基乙酰丙酸合成酶的活性,且增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性,且弱化琥珀酰辅酶A合成酶的活性,且弱化5
‑
氨基乙酰丙酸脱水酶的活性,且弱化异柠檬酸裂解酶的活性,且增强泛酸激酶的活性,且增强5
‑
ALA转运蛋白的活性,且增强5
‑
ALA氧化损伤修复系统相关蛋白的活性。
[0009]优选地,所述增强5
‑
氨基乙酰丙酸合成酶的活性,增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性,增强泛酸激酶的活性,增强5
‑
ALA转运蛋白的活性,增强5
‑
ALA氧化损伤修复系统相关蛋白的活性是通过增加编码蛋白的多核苷酸的拷贝数、对编码蛋白的基因的调控序列进行修饰、用具有强活性的序列置换染色体上编码蛋白的基因的调控序列、用突变基因置换编码蛋白的基因、在染色体上编码蛋白质的基因中引入修饰以增强蛋白质的活性。
[0010]更优先地,所述弱化琥珀酰辅酶A合成酶的活性,弱化5
‑
氨基乙酰丙酸脱水酶的活性,弱化异柠檬酸裂解酶的活性是通过部分或全部敲除酶的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定、通过sRNA对基因进行弱化调控、通过外源性添加酶活性的抑制剂以弱化其活性。
[0011]进一步优选地,所述5
‑
ALA转运蛋白是半胱氨酸/O
‑
乙酰丝氨酸转运蛋白,所述5
‑
ALA氧化损伤修复系统相关蛋白是谷氧还蛋白I。所述5
‑
氨基乙酰丙酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID No:49所示,或所述5
‑
氨基乙酰丙酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID No:49所示序列的75位由半胱氨酸突变为丙氨酸,365位的精氨酸突变为赖氨酸。
[0012]更进一步优选地,所述菌株为大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。
[0013]第二方面,本专利技术提供了一种高产5
‑
ALA的重组工程菌株,其特征在于,所述菌株的5
‑
氨基乙酰丙酸合成酶活性增强,且磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性增强,且琥珀酰辅酶A合成酶活性减弱,且5
‑
氨基乙酰丙酸脱水酶活性减弱,且异柠檬酸裂解酶活性减弱,且泛酸激酶活性增强,且5
‑
ALA转运蛋白活性增强,且5
‑
ALA氧化损伤修复系统相关蛋白的活性增强。
[0014]优选地,所述增强5
‑
氨基乙酰丙酸合成酶的活性,增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性,增强泛酸激酶的活性,增强5
‑
ALA转运蛋白的活性,增强5
...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种构建5
‑
ALA高产工程菌株的方法,其特征在于,增强菌株中5
‑
氨基乙酰丙酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、5
‑
ALA转运蛋白以及5
‑
ALA氧化损伤修复系统相关蛋白的活性,并且弱化或敲除琥珀酰辅酶A合成酶、5
‑
氨基乙酰丙酸脱水酶以及异柠檬酸裂解酶的活性。2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述增强5
‑
氨基乙酰丙酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、泛酸激酶、5
‑
ALA转运蛋白、5
‑
ALA氧化损伤修复系统相关蛋白的活性是通过增加编码蛋白的多核苷酸的拷贝数、对编码蛋白的基因的调控序列进行修饰、用具有强活性的序列置换染色体上编码蛋白的基因的调控序列、用突变基因置换编码蛋白的基因、在染色体上编码蛋白质的基因中引入修饰以增强蛋白质的活性。3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述弱化琥珀酰辅酶A合成酶、5
‑
氨基乙酰丙酸脱水酶、异柠檬酸裂解酶的活性是通过部分或全部敲除酶的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定、通过sRNA对基因进行弱化调控、通过外源性添加酶活性的抑制剂以弱化其活性。4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述...
【专利技术属性】
技术研发人员:孙际宾,陈久洲,蒲伟,郑平,周文娟,石拓,蔡柠匀,
申请(专利权)人:中国科学院天津工业生物技术研究所,
类型:发明
国别省市:
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。