一种工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种工程菌及其构建方法和应用。本发明专利技术第一方面提供一种工程菌，所述工程菌为过表达甲基化酶的大肠杆菌，所述甲基化酶用于对外源基因进行甲基化修饰；所述甲基化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术提供的工程菌能够对外源基因进行甲基化修饰，提高外源基因在须糖多孢菌内的转化效率，为须糖多孢菌的基因工程改造提供重要基础。础。础。

【技术实现步骤摘要】
一种工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种工程菌及其构建方法和应用，涉及基因工程


技术介绍

[0002]外源DNA转化技术是基因工程和DNA克隆技术发展的基础和核心，是现代分子生物学中最重要的操作手段之一。常见的转化方法包括化学转化和电击转化，对于实验室标准菌株一般具备相对较高的转化效率，但是对于某些环境中筛选的菌株或者工业菌株，外源DNA的转化效率一般较低。
[0003]例如，丁烯基多杀菌素(butenyl
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spinosyns)是一种新型大环内酯类天然产物，具有高效生物杀虫活性，是理想的绿色生物杀虫剂。常见的生产方法是利用土壤放线菌须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)的次级代谢产生，但是，野生型须糖多孢菌合成丁烯基多杀菌素的能力较弱、产量较低，需要利用基因工程技术改造须糖多孢菌以获得高产丁烯基多杀菌素的工程化菌株。但是，须糖多孢菌具有很强的限制性修饰系统，当外源基因进入细胞后会被快速降解，导致须糖多孢菌的遗传操作非常困难，限制了高产丁烯基多杀菌素工程菌株的构建。
[0004]限制性修饰系统通常包括限制酶和修饰酶，限制酶是一种核酸内切酶，能够对外源DNA进行切割，修饰酶能够对自身DNA进行甲基化修饰。为了克服须糖多孢菌自身的限制性修饰系统，可以通过对外源基因进行甲基化修饰，使得修饰后的外源基因不被须糖多孢菌自身的限制性修饰系统剪切降解，从而提高外源基因的转化效率。因此，如何对外源基因进行甲基化修饰，提高外源基因在须糖多孢菌内的转化效率，受到了本领域技术人员的持续关注。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种工程菌，其能够过表达如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的甲基化酶，能够对外源基因进行甲基化修饰，提高外源基因在须糖多孢菌中的转化效率。
[0006]本专利技术还提供上述工程菌的构建方法。
[0007]本专利技术还提供一种提高须糖多孢菌外源基因转化效率的方法，通过将外源基因导入上述工程菌内进行甲基化修饰，提高外源基因在须糖多孢菌内的转化效率。
[0008]本专利技术第一方面提供一种工程菌，所述工程菌为能够过表达甲基化酶的大肠杆菌，所述甲基化酶用于对外源基因进行甲基化修饰；
[0009]所述甲基化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。
[0010]本专利技术提供的甲基化酶来源于须糖多孢菌(S.pogona ASAGF58)，通过生物信息学比对分析，发现须糖多孢菌基因组上存在三种甲基化酶，分别命名为甲基化酶04455、28970和29090，甲基化酶04455的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，甲基化酶28970的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，二者均能够对外源基因进行甲基化修饰，并提高外源基因在须糖多孢菌内的转化效率，具体地，甲基化酶28970的转化效率为20.5CFU/ug DNA，甲基化酶04455的
转化效率为57.5CFU/ug DNA，而甲基化酶29090的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其对外源基因在须糖多孢菌中的转化效率没有提升，因此，构建能够过表达甲基化酶04455或28970的工程菌，能够对外源基因进行甲基化修饰，提高外源基因在须糖多孢菌内的转化效率，对须糖多孢菌后续的基因工程改造提供重要基础。
[0011]在一种优选实施例中，基于甲基化酶04455对外源基因在须糖多孢菌中的转化效率较高，构建能够外源表达甲基化酶04455的工程菌，所述甲基化酶04455的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]进一步地，所述大肠杆菌为ET12567，大肠杆菌ET12567是一种甲基化缺陷型菌株，导入的基因序列不会被菌株的甲基修饰系统降解，是链霉菌基因敲除或者基因倍增通用的菌株，本领域技术人员可根据本领域常规技术手段购买得到。
[0013]本专利技术第二方面提供上述任一所述工程菌的构建方法，包括：将编码所述甲基化酶的基因整合到大肠杆菌的基因组上，实现所述甲基化酶的过表达，得到所述工程菌；
[0014]所述甲基化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。
[0015]在一种具体实施方式中，所述方法包括：
[0016]步骤1、将编码所述甲基化酶的基因、启动子J23119和核糖体结合位点B0034连接，构建得到甲基化酶的表达盒；
[0017]具体地，经过密码子优化，编码所述甲基化酶04455的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述甲基化酶28970的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0018]编码甲基化酶的基因在大肠杆菌内的表达需要启动子和核糖体结合位点的驱动作用，具体地，本专利技术所使用的启动子为启动子J23119，核糖体结合位点为B0034，其能够启动下游基因的表达，并具有较高的强度，具体地，启动子J23119和核糖体结合位点B0034可参照文献(Systematic Analysis of Escherichia coli Isolates from Sheep and Cattle Suggests Adaption to the Rumen Niche)，或者可以通过网站http://parts.igem.org/Main_Page查询得到。
[0019]此外，为了阳性转化子的筛选，表达盒的构建还需要加入抗性序列，具体地，本专利技术使用的抗性序列为Kan抗性序列，在转化子筛选过程中，将转化后的大肠杆菌在含有壮观霉素的培养基上培养，而Kan抗性序列表达的酶能够降解壮观霉素，使得大肠杆菌正常生长，从而筛选出阳性转化子。
[0020]通过本领域常规技术手段，按照图1所述的顺序，将启动子J23119、核糖体结合位点B0034、编码甲基化酶的基因序列和Kan抗性序列依次连接，构建得到甲基化酶的表达盒。
[0021]步骤2、培养感受态大肠杆菌，并将所述表达盒导入感受态大肠杆菌中，筛选阳性转化子，得到所述工程菌。
[0022]本专利技术通过培养感受态细胞实现外源DNA分子的导入，首先，诱导大肠杆菌为感受态细胞，具体地，通过电击转化或者化学转化的方法将pTKRED质粒转入大肠杆菌中，在一定条件下培养，挑取单克隆进行液体过夜培养，随后添加IPTG进行诱导，制备得到感受态大肠杆菌。
[0023]其次，将步骤1制备得到的表达盒与感受态大肠杆菌混合，通过电极转化将构建有目的基因的表达盒导入感受态大肠杆菌中，最后对大肠杆菌进行培养，筛选阳性转化子，得到工程菌。
[0024]本专利技术第三方面提供上述工程菌在对外源基因进行甲基化修饰并提高所述外源基因在须糖多孢菌中的转化效率中的应用。
[0025]本专利技术提供的上述工程菌能够对外源基因进行甲基化修饰，得到甲基化修饰后的外源基因，甲基化修饰后的外源基因即可导入须糖多孢菌中，并提高转化效率。
[0026]本专利技术中“外源基因”可以是任何需要转化到须糖多孢本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌为能够过表达甲基化酶的大肠杆菌，所述甲基化酶用于对外源基因进行甲基化修饰；所述甲基化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述甲基化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为ET12567。4.权利要求1
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3任一项所述工程菌的构建方法，其特征在于，包括：将编码所述甲基化酶的基因整合到大肠杆菌的基因组上，实现所述甲基化酶的过表达，得到所述工程菌；所述甲基化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将编码所述甲基化酶的基因、启动子J23119和核糖体结合位点B0034连接，构建得到甲基化酶的表达盒，并将所述表达盒转入大肠杆菌，筛选阳性转化子，得到所述工程菌。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，编码所述甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春，庞建，王超，郭超，
申请(专利权)人：国家粮食和物资储备局科学研究院，
类型：发明
国别省市：