产L-高丝氨酸重组基因工程菌、构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种产L

【技术实现步骤摘要】
产L
‑
高丝氨酸重组基因工程菌、构建方法及应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种产L
‑
高丝氨酸的重组基因工程菌及其构建方法，以及其在微生物发酵制备L
‑
高丝氨酸中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]高丝氨酸又名2
‑
氨基
‑4‑
羟基丁酸，分为L
‑
高丝氨酸和D
‑
高丝氨酸两种同分异构体，属于L
‑
天冬氨酸族非蛋白质氨基酸，是合成必需氨基酸L
‑
苏氨酸、L
‑
甲硫氨酸和L
‑
异亮氨酸的前体物。L
‑
高丝氨酸及其衍生物是生物合成L
‑
蛋氨酸的前体，同时也是合成多种C4化合物(异丁醇、γ
‑
丁内酯、1,4
‑
丁二醇、2,4
‑
二羟基丁酸)和L
‑
草铵膦等的平台化合物。在已报道的L
‑
高丝氨酸及其衍生物合成技术路线中，化学法因反应过程中所使用的试剂价格昂贵，反应时间长或者提纯步骤繁琐等因素限制了其发展。酶催化法利用丙酮酸和甲醛在缩醛酶和L
‑
氨基酸脱氢酶的共同作用下生成高丝氨酸，该工艺所需原料甲醛有毒，且辅酶价格昂贵；微生物发酵法具有绿色高效，底物廉价易得等优势备受人们的关注。
[0003]随着对微生物代谢过程的不断了解，以及代谢改造技术(系统代谢工程、合成生物学、启动子工程、蛋白质工程及转录组和代谢组)的不断发展，利用廉价葡萄糖等为碳源来生产包括L
‑
高丝氨酸在内的多种高附加值产物具备广阔的生产应用前景。然而，由于野生型大肠杆菌本身生理特性，在大肠杆菌细胞中合成的L
‑
高丝氨酸只能满足自身生长所需，不会大量积累，所以必须对L
‑
高丝氨酸的合成途径理性改造，构建稳定高效的细胞工厂。高产L
‑
高丝氨酸的菌株可以由基因工程和代谢工程等策略获得。但是在基因工程菌构建的过程中需要考虑到不同代谢途径之间关联，在提高目的产物代谢通量的同时不能影响细胞的正常生长，所以需要从多个角度出发进行理性代谢工程改造。目前，利用生物法生产L
‑
高丝氨酸及其衍生物的过程仍存在一些不足之处，如发酵产量不高或糖酸转化率过低等现象。因此，构建高效的微生物细胞工厂用于生产L
‑
高丝氨酸及其衍生物仍是一大挑战。
(三)
技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种产L
‑
高丝氨酸的重组基因工程菌及其构建方法，以及其在微生物发酵制备L
‑
高丝氨酸中的应用。
[0005]本专利技术采用的技术方案是：
[0006]产L
‑
高丝氨酸的重组基因工程菌，由如下方法构建获得：以菌株E.coli W3110(Trc
‑
panDTrc
‑
ppCTrc
‑
aspCΔpykAΔcycA)(记为菌株HS1)为底盘菌株，回补panD基因原始启动子，解除thrA基因的反馈抑制(thrA
*
)，敲除pcK基因、thrB基因、metA基因，将ppC基因、nadK基因、rhtA基因、metL基因的启动子分别替换成启动子Trc，在E.coli W3110基因组中fliK、ompT、ylbE等假基因位点分别过表达thrA
*
、ppC、rhtA，在质粒pTrc99a上过表达thrA
*
基因和aspB
(cg)
基因，构建质粒pTrc99a
‑
thrA
*
‑
aspB
(cg)
并转化前述菌株中，得到所述产L
‑
高丝氨酸的重组基因工程菌。
[0007]本专利技术改造了大肠杆菌的L
‑
高丝氨酸合成网络，通过解除thrA编码的天冬氨酸激
酶/高丝氨酸脱氢酶I的反馈抑制，克服了原始菌株中thrA编码的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶I由于反馈抑制导致的活力不足的缺陷，使天冬氨酸能够顺利合成L
‑
高丝氨酸，增加天冬氨酸转化为L
‑
高丝氨酸的通量，构建菌株HS3；通过强化L
‑
苏氨酸/L
‑
高丝氨酸外运蛋白基因rhtA，减少了胞内L
‑
高丝氨酸的浓度，从而提高了发酵液中L
‑
高丝氨酸的浓度，构建菌株HS4；通过过表达thrA
*
(编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶I)基因，强化天冬氨酸到L
‑
高丝氨酸的合成途径，从而增加L
‑
高丝氨酸合成方向的碳流量，构建菌株HS5；通过Trc启动子替换L
‑
高丝氨酸合成途径的metL原始启动子，增加合成途径中碳流量，强化天冬氨酸到L
‑
高丝氨酸合成途径的代谢通量，从而增加L
‑
高丝氨酸的产量，构建菌株HS6；通过过表达编码磷酸烯醇式丙酮酸脱羧酶的ppC基因，强化磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的代谢通量，为天冬氨酸的合成增加前提供应，构建菌株HS7；通过敲除pcK，减少草酰乙酸到磷酸烯醇式丙酮酸的可逆反应，从而更好的积累天冬氨酸的前体物质草酰乙酸，构建菌株HS8；通过过表达L
‑
苏氨酸/L
‑
高丝氨酸外运蛋白基因rhtA，进一步强化L
‑
高丝氨酸的外排，从而更好的积累目的产物L
‑
高丝氨酸，构建菌株HS9；通过敲除苏氨酸、O
‑
琥珀酰高丝氨酸竞争支路的碳流量，即敲除thrB、metA减少竞争支路苏氨酸、O
‑
琥珀酰高丝氨酸的合成，从而增加L
‑
高丝氨酸合成方向的碳流量，构建菌株HS11；通过敲除乙酸生成途径，即敲除poxB，减少碳损失，构建菌株HS12；随后利用Trc启动子替换nadK基因原始启动子，提高胞内NADPH的可用性，为L
‑
高丝氨酸合成途径提供充分的NADPH，构建菌株HS13；最后在质粒pTrc99a上过表达解除反馈抑制的thrA
*
基因和来源于谷氨酸棒状杆菌的aspB
(cg)
基因，最大水平增加L
‑
高丝氨酸的产量，构建质粒pTrc99a
‑
thrA
*
‑
aspB
(cg)
并转化到菌株HS13中，得到菌株：E.coli W3110Trc
‑
ppCTrc
‑
aspCΔpykAΔcycAthra*Trc
‑
rhtAΔfliK::Trc
‑
thrA*Trc
‑
metLΔompT::Trc...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.产L
‑
高丝氨酸的重组基因工程菌，由如下方法构建获得：以菌株E.coli W3110(Trc
‑
panDTrc
‑
ppCTrc
‑
aspCΔpykAΔcycA)为底盘菌株，回补panD基因原始启动子，解除thrA基因的反馈抑制，敲除pcK基因、thrB基因、metA基因，将ppC基因、nadK基因、rhtA基因、metL基因的启动子分别替换成启动子Trc，在E.coli W3110基因组中fliK、ompT、ylbE假基因位点分别过表达thrA
*
、ppC、rhtA，在质粒pTrc99a上过表达thrA
*
基因和aspB
(cg)
基因，构建质粒pTrc99a
‑
thrA
*
‑
aspB
(cg)
并转化前述菌株中，得到所述产L
‑
高丝氨酸的重组基因工程菌。2.构建权利要求1所述基因工程菌的方法，所述方法包括：(1)以菌株E.coli W3110(Trc
‑
panDTrc
‑
ppCTrc
‑
aspCΔpykAΔcycA)为底盘菌株，应用CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术，回补panD基因原始启动子，得到工程菌HS2；(2)应用CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术，将工程菌HS2的thrA基因解除反馈抑制，得到工程菌HS3；(3)将HS3基因组上rhtA基因原始启动子替换成强启动子Trc，得到工程菌HS4；(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将添加上Trc启动子的解除反馈抑制的thrA
*
基因替换fliK基因，得到工程菌HS5；(5)将菌株HS5基因组上的metL基因原始启动子替换成强启动子Trc，得到工程菌HS6；(6)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将添加上Trc启动子的ppC基因替换ompT基因，得到工程菌HS7；(7)将菌株HS7基因组上的pcK基因敲除，得到工程菌HS8；(8)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将添加上Trc启动子的rhtA基因替换ylbE基因，得到工程菌HS9；(9)将菌株HS9基因组上的thrB基因敲除，得到工程菌HS10；(10)将菌株HS10基因组上的metA基因敲除，得到工程菌HS11；(11)将菌株HS11基因组上的poxB基因敲除，得到工程菌HS12；(12)将菌株HS12基因组上的nadK基因原始启动子替换成强启动子Trc...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，吴琦，张博，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：