一种生产假尿苷的基因工程菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种生产假尿苷的基因工程菌株，所述基因工程菌异源过表达嘧啶核苷操纵子，过表达假尿苷酸合成酶，过表达核糖激酶，过表达核糖核苷水解酶，过表达尿嘧啶渗透酶，不表达假尿苷转运蛋白和假尿苷激酶。本发明专利技术从大肠杆菌基因组水平出发，主要通过代谢工程技术手段，对尿苷酸合成途径、假尿苷合成途径、转运系统及假尿苷分支代谢途径各模块进行系统全面的组合优化，提高菌株的假尿苷发酵性能。本基因工程菌株的假尿苷产量高、生产性能稳定、能用于假尿苷生产。能用于假尿苷生产。能用于假尿苷生产。

【技术实现步骤摘要】
一种生产假尿苷的基因工程菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及工业微生物的育种，尤其是一种生产假尿苷的基因工程菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]假尿苷又称5
‑
B
‑
D
‑
核呋喃基尿嘧啶，分子式为C9H
12
N2O6，分子量为244.201。假尿苷是一种嘧啶核苷，是尿苷的5位核糖异构体，核糖不与尿嘧啶N1相连，而与嘧啶环的C5连接。假尿苷是RNA上最丰富的修饰核苷，又被称为RNA的“第五种核苷”，在mRNA新冠疫苗中具有重要的应用价值。将假尿苷及其类似物替换尿苷加入mRNA，可以解决mRNA药物容易被免疫系统识别而被清除、产生免疫副反应的问题。同时，假尿苷作为一种RNA的代谢产物，具有仅从肾脏排泄的特点，在临床医学上可用于监测肿瘤的发生、发展及肾病的诊治等。假尿苷具有十分重要的应用价值，随着假尿苷市场需求量的不断扩大，迫切需要开发廉价的可大规模应用的假尿苷生产工艺。
[0003]假尿苷的生产方法有化学合成法、化学酶法、微生物发酵法。而目前，关于假尿苷的制备方面的报道颇少。李静简等人以2，3，5
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三苄氧基
‑
D
‑
核糖酸
‑
1，4
‑
内酯为原料与2，4
‑
二烷氧基
‑5‑
溴嘧啶进行加成反应，而后依次与三乙基硅烷、三氟化硼乙醚进行还原反应，最后用三氯化硼进行脱保护反应得到假尿苷(ZL202210798651.4)；金峰等人以D
‑
核糖和尿嘧啶为起始反应物，在有机溶剂中加入乙酰溴与D
‑
核糖反应以及在有机溶剂中使用强路易斯碱后加入(Boc)2O与尿嘧啶反应，两者发生缩合反应后使用三氟乙酸脱去保护基，而后加入乙酸酐进行手性拆分，最后脱去保护基得到假尿苷(ZL202210473532.1)。虽说假尿苷的生产方法主要依赖于化学方法合成，但是化学合成过程中存在合成步骤长、生产成本高、收率低等问题，并且使用易燃易爆等危险试剂。肖聪等人专利技术了一种化学酶法来合成假尿苷，使用5
’‑
假尿苷单磷酸糖苷酶突变体催化5
‑
磷酸核糖与尿嘧啶合成5
’‑
假尿苷单磷酸，再经化学去磷酸化、分离后得到假尿苷(ZL202111581013.9)。但是该方法也存在原料成本高、生产工艺复杂、转化率低等缺点。与上述方法相比，微生物发酵法具有环境友好、成本低廉、工艺简单、生产可持续等优势。陈伟等人筛选得到了一种链霉菌，可以通过有氧发酵产生1.36g/L的假尿苷(ZA202011421953.7)。进一步，将来自于链霉菌Streptomyces sp.ID38640中的假尿苷合成基因pumH、pumJ和pumD基因克隆至大肠杆菌体内，转化得到可产7.2g/L假尿苷的工程菌(ZL202011637153.9)。但是该工程菌携带质粒、生长负担重、产量较低且发酵周期长。
[0004]利用代谢工程和合成生物技术选育核苷类产品生产菌株是近年来研究的热点。本专利技术从大肠杆菌基因组水平出发，主要通过代谢工程技术手段，对尿苷酸合成途径、假尿苷合成途径、转运系统及假尿苷分支代谢途径各模块进行系统全面的组合优化，提高菌株的假尿苷发酵性能。
[0005]通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种生产假尿苷的基因工程菌株及其构建方法与应用。
[0007]本专利技术解决技术问题所采用的技术方案是：
[0008]一种生产假尿苷的基因工程菌株，所述基因工程菌异源过表达嘧啶核苷操纵子，过表达假尿苷酸合成酶，过表达核糖激酶，过表达核糖核苷水解酶，过表达尿嘧啶渗透酶，不表达假尿苷转运蛋白和假尿苷激酶。
[0009]进一步地，所述嘧啶核苷操纵子为枯草芽孢杆菌pyrBCAKDFE基因编码的操纵子，核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
[0010]所述假尿苷酸合成酶为大肠杆菌yeiN基因(NCBI
‑
GeneID:946699)编码的蛋白或海栖热袍菌TM1464基因(NCBI
‑
GeneID:896983)编码的蛋白或根癌农杆菌AWN88_14600基因(NCBI
‑
GeneID:29364903)编码的蛋白；
[0011]所述核糖激酶为大肠杆菌rbsK基因(NCBI
‑
GeneID:948260)编码的蛋白或枯草芽孢杆菌rbsK基因(NCBI
‑
GeneID:936844)编码的蛋白；
[0012]所述核糖核苷水解酶为大肠杆菌rihA基因(NCBI
‑
GeneID:945503)或大肠杆菌rihB基因(NCBI
‑
GeneID:946646)或大肠杆菌rihC基因(NCBI
‑
GeneID:944796)编码的蛋白；
[0013]所述尿嘧啶渗透酶为大肠杆菌uraA基因(NCBI
‑
GeneID:946978)编码的蛋白；
[0014]所述假尿苷转运蛋白为大肠杆菌psuT基因(NCBI
‑
GeneID:946671)编码的蛋白；
[0015]所述假尿苷激酶为大肠杆菌yeiI基因(NCBI
‑
GeneID:946640)和大肠杆菌yeiC基因(NCBI
‑
GeneID:946664)编码的蛋白。
[0016]进一步地，所述嘧啶核苷操纵子的基因连接有启动子P
trc
；和/或
[0017]所述假尿苷酸合成酶的基因连接有启动子P
trc
；和/或
[0018]所述核糖激酶的基因连接有启动子P
trc
；和/或
[0019]所述核糖核苷水解酶的基因连接有启动子P
trc
；和/或
[0020]所述尿嘧啶渗透酶的基因连接有启动子P
trc
；
[0021]其中，所述启动子P
trc
的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0022]进一步地，所述基因工程菌株在构建时使用的出发菌株为大肠杆菌。
[0023]进一步地，所述大肠杆菌为E.coli MG1655。
[0024]如上所述的基因工程菌株的构建方法，所述方法包括如下步骤：
[0025]在出发菌株中过表达枯草芽孢杆菌来源的嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE，过表达大肠杆菌内源的假尿苷酸合成酶基因yeiN或海栖热袍菌的假尿苷酸合成酶基因TM1464或根癌农杆菌的假尿苷酸合成酶基因AWN88_14600，过表达大肠杆菌内源的核糖激酶基因rbsK或枯草芽孢杆菌的核糖激酶基因rbsK，过表达本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产假尿苷的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌异源过表达嘧啶核苷操纵子，过表达假尿苷酸合成酶，过表达核糖激酶，过表达核糖核苷水解酶，过表达尿嘧啶渗透酶，不表达假尿苷转运蛋白和假尿苷激酶。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述嘧啶核苷操纵子为枯草芽孢杆菌pyrBCAKDFE基因编码的操纵子，核苷酸序列为SEQ ID NO.1；所述假尿苷酸合成酶为大肠杆菌yeiN基因(NCBI
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GeneID:946699)编码的蛋白或海栖热袍菌TM1464基因(NCBI
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GeneID:896983)编码的蛋白或根癌农杆菌AWN88_14600基因(NCBI
‑
GeneID:29364903)编码的蛋白；所述核糖激酶为大肠杆菌rbsK基因(NCBI
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GeneID:948260)编码的蛋白或枯草芽孢杆菌rbsK基因(NCBI
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GeneID:936844)编码的蛋白；所述核糖核苷水解酶为大肠杆菌rihA基因(NCBI
‑
GeneID:945503)或大肠杆菌rihB基因(NCBI
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GeneID:946646)或大肠杆菌rihC基因(NCBI
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GeneID:944796)编码的蛋白；所述尿嘧啶渗透酶为大肠杆菌uraA基因(NCBI
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GeneID:946978)编码的蛋白；所述假尿苷转运蛋白为大肠杆菌psuT基因(NCBI
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GeneID:946671)编码的蛋白；所述假尿苷激酶为大肠杆菌yeiI基因(NCBI
‑
GeneID:946640)和大肠杆菌yeiC基因(NCBI
‑
GeneID:946664)编码的蛋白。3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌株，其特征在于：所述嘧啶核苷操纵子的基因连接有启动子P
trc
；和/或所述假尿苷酸合成酶的基因连接有启动子P
trc
；和/或所述核糖激酶的基因连接有启动子P
trc
；和/或所述核糖核苷水解酶的基因连接有启动子P
trc
；和/或所述尿嘧啶渗透酶的基因连接有启动子P
trc
；其中，所述启动子P
trc
的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1或2所述的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株在构建时使用的出发菌株为大肠杆菌。5.根据权利要求4所述的基因工程菌株，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coli MG1655。6.如权利要求1至5任一所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：在出发菌株中过表达枯草芽孢杆菌来源的嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE，过表达大肠杆菌内源的假尿苷酸合成酶基因yeiN或海栖热袍菌的假尿苷酸合成酶基因TM1464或根癌农杆菌的假尿苷酸合成酶基因AWN88_14600，过表达大肠杆菌内源的核糖激酶基因rbsK或枯草芽孢杆菌的核糖激酶基因rbsK，过表达大肠杆菌内源的核糖核苷水解酶基因rihA或rihB或rihC，过表达大肠杆菌内源的尿嘧啶渗透酶基因uraA，敲除或失活假尿苷转运蛋白基因psuT，敲除或失活假尿苷激酶基因yeiI和yeiC。所...

【专利技术属性】
技术研发人员：范晓光，王倩倩，安俊侠，刘亚琦，刘欢，徐庆阳，陈宁，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：