一种提高生物合成甲基硒代半胱氨酸产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高生物合成甲基硒代半胱氨酸产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术以枯草芽孢杆菌为宿主，表达编码SMT蛋白的基因、编码SATp蛋白的基因和甲硫氨酸腺苷转移酶基因，强化了甲基硒代半胱氨酸在重组枯草芽孢杆菌中的胞内表达。采用该方法制备甲基硒代半胱氨酸，可大大的降低生产成本，并且该方法不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物；有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化SeMCys的生产。工业化SeMCys的生产。工业化SeMCys的生产。

【技术实现步骤摘要】
一种提高生物合成甲基硒代半胱氨酸产量的方法


[0001]本专利技术涉及一种提高生物合成甲基硒代半胱氨酸产量的方法，属于生物工程


技术介绍

[0002]硒是人体必需的微量元素，通过形成以硒代半胱氨酸为活性中心的硒蛋白行使生理功能。甲基硒代半胱氨酸(SeMCys)可以作为硒源类补充剂，也被证明是最有效的抗癌硒化合物之一，对改善神经疾病和认知缺陷有潜在的作用。
[0003]目前SeMCys的制备方法主要是化学合成法，但是这些化学合成方法存在步骤复杂、工艺冗长、反应条件苛刻和环境不友好等问题。
[0004]甲基硒代半胱氨酸在黄芪属植物中能够被合成，在质体中积累，提升了植物的耐硒能力，双沟黄芪幼芽中积累量最高，为52.2μg/g鲜重。但是植物生长周期长，占用空间大，人力成本高，不利于大规模制备。
[0005]利用微生物合成甲基硒代半胱氨酸可以实现目的产物的大规模绿色生物制造。目前仅在一些天然蕈菌中能检测到甲基硒代半胱氨酸的合成，但均作为对检测方法的验证，没有公布确切含量。酵母是富硒能力很强的微生物，可在胞内积累硒代甲硫氨酸，利用酿酒酵母作为宿主，进行代谢改造，发酵过程优化后，胞内甲基硒代半胱氨酸含量仅为1.14μg/g干重。利用食品级的基因工程菌强化甲基硒代半胱氨酸的合成并提高产量，将有利于提升基因工程菌的工业化应用潜力。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主，在基因组上硒代半胱氨酸甲基转移酶SMT基因和丝氨酸乙酰基转移酶SATp基因，克服多个质粒复制引起的代谢负担使菌体生物量明显降低的缺陷，并通过pHT01质粒诱导表达甲硫氨酸腺苷转移酶。
[0007]在一种实施方式中，所述甲硫氨酸腺苷转移酶为大肠杆菌来源的具有I303V,I65V,L186V,N104K四突变的MetK和酿酒酵母来源的SAM2。
[0008]在一种实施方式中，所述SMT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述SMT蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]在一种实施方式中，所述SATp蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码所述SATp蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]在一种实施方式中，大肠杆菌来源的甲硫氨酸腺苷转移酶I303V/I65V/L186V/N104K四突变体MetK的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；酿酒酵母来源的甲硫氨酸腺苷转移酶SAM2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0011]在一种实施方式中，编码大肠杆菌来源的甲硫氨酸腺苷转移酶I303V/I65V/L186V/N104K四突变体MetK的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码酿酒酵母来源的甲硫氨
酸腺苷转移酶SAM2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012]在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主，将P
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SMT表达框和P
grac
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SATp表达框整合到枯草芽孢杆菌基因组AmyE位点上，再以pHT01质粒为载体，表达编码甲硫氨酸腺苷转移酶的基因。
[0013]本专利技术还提供了一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0014](1)将编码SMT蛋白的基因和pP43NMK载体进行Gibson组装，得到载体pP43NMK
‑
SMT；将SATp蛋白的基因和pHT01载体进行Gibson组装，得到载体pHT01
‑
SATp；分别克隆AmyE上游片段LB和下游片段RB，并经过融合PCR连接为一个片段，构建到pMD19克隆载体上，得到pMD
‑
LB
‑
RB载体；分别扩增P
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‑
SMT表达框片段和pMD
‑
LB
‑
RB载体成线性片段，并通过Gibson组装得到pMD
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LB
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SMT
‑
RB载体；分别扩增P
grac
‑
SATp表达框片段和pMD
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LB
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SMT
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RB载体成线性片段，并通过Gibson组装得到pMD
‑
LB
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SMT
‑
SATp
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RB载体；扩增LB
‑
SMT
‑
SATp
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RB片段作为donor DNA；选择23bp的AmyE片段，连接到pcrF11载体上，构建导向RNA质粒；将含有重组酶的质粒pHT
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XCR6先转化至枯草芽孢杆菌中，在转化子中将导向RNA质粒和LB
‑
SMT
‑
SATp
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RB片段进行共转化，筛选基因组整合的转化子GBA；
[0015](2)将编码甲硫氨酸腺苷转移酶的基因MetK和SAM2分别与载体pHT01进行Gibson组装，得到pHT01
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MetK和pHT01
‑
SAM2载体，将重组载体转入到步骤(1)获得的重组菌GBA中，得到重组枯草芽孢杆菌GBA
‑
甲硫氨酸腺苷转移酶。
[0016]本专利技术还提供了所述重组枯草芽孢杆菌在生产甲基硒代半胱氨酸方面的应用。
[0017]在一种实施方式中，将所述重组枯草芽孢杆菌的种子液接种至发酵培养基中，于温度为30～38℃、转速为150～300rpm的条件下培养，收集表达的甲基硒代半胱氨酸的菌体。
[0018]在一种实施方式中，所述应用还包括破碎菌体，收集甲基硒代半胱氨酸。
[0019]在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的种子液菌浓不低于OD 1.0。
[0020]在一种实施方式中，所述应用是将所述种子液接种至发酵培养基中，于33℃、250r/min培养OD
600
至0.6～0.8时加入1mM IPTG，诱导至OD
600
至1.8～2.0时添加6～12mg/L亚硒酸钠，继续发酵40h。
[0021]本专利技术还提供了上述重组枯草芽孢杆菌或上述构建方法得到的重组枯草芽孢杆菌或上述制备甲基硒代半胱氨酸的方法在制备甲基硒代半胱氨酸或含甲基硒代半胱氨酸产品中的应用。
[0022]有益效果：
[0023](1)本专利技术提升了甲基硒代半胱氨酸在重组枯草芽孢杆菌中的合成，采用该方法制备甲基硒代半胱氨酸，可大大的降低生产成本；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物；有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化SeMCys的生产。
[0024](2)本专利技术通过表达甲硫氨酸腺苷转移酶提升了枯草芽孢杆菌的SAM合成，并利用强化硒代半胱氨酸合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为宿主，在基因组上整合硒代半胱氨酸甲基转移酶基因和丝氨酸乙酰基转移酶基因，并通过质粒表达甲硫氨酸腺苷转移酶。2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述硒代半胱氨酸甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述丝氨酸乙酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。3.根据权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以启动子P
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调控硒代半胱氨酸甲基转移酶的表达，以启动子P
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调控丝氨酸乙酰基转移酶的表达。4.根据权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以pHT01质粒为载体表达甲硫氨酸腺苷转移酶。5.一种构建权利要求4所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为宿主，将P
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SMT表达框和P
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【专利技术属性】
技术研发人员：殷娴，王凤寰，廖永红，周瑜，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：