一种大肠杆菌表达重组尿酸氧化酶的发酵方法技术

本发明专利技术涉及一种大肠杆菌表达重组尿酸氧化酶的发酵方法，属于医药生物工程技术领域。解决现有技术中使用酿酒酵母生产重组黄曲霉尿酸氧化酶时，发酵周期较长并且工艺控制复杂，蛋白表达水平不理想，从而导致了最终产品的价格居高不下的技术问题。本发明专利技术提供的一种大肠杆菌表达重组尿酸氧化酶的发酵方法，是将大肠杆菌基因工程菌经一级种子培养、二级种子培养、种子罐培养、发酵罐培养4个阶段生产重组尿酸氧化酶的发酵工艺，发酵周期短至6小时左右，蛋白表达量高达50％～60％，菌种是硫酸卡那霉素抗性。那霉素抗性。那霉素抗性。

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌表达重组尿酸氧化酶的发酵方法


[0001]本专利技术属于医药生物工程
，具体涉及一种大肠杆菌表达重组尿酸氧化酶的发酵方法。

技术介绍

[0002]尿酸氧化酶(Urate Oxidase，Uricase；EC1.7.3.3)，也称为尿酸酶，是嘌呤降解途径中重要的酶，能以分子氧作为受体催化相对不溶性尿酸分解生成高溶解性尿囊素、二氧化碳和过氧化氢。
[0003]近年来有许多报道利用尿酸氧化酶来治疗肿瘤溶解综合症。肿瘤溶解综合症是在白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等血液肿瘤化疗时肿瘤细胞大量溶解，胞内核酸大量降解，血浆尿酸急剧升高，引起高尿酸血症为主的代谢紊乱和造成患者肾脏衰竭而死亡的现象。传统的预防和治疗高尿酸症的方法是利用别嘌呤醇，碱化尿酸水解尿酸，但碱化会产生副作用，例如加剧血液高磷酸盐症和低血钙症，使病人的病症更加复杂化。Stanton C等人在1996
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1997年对52个病人的研究证明了尿酸氧化酶是传统的别嘌呤醇的一种安全、有效的替代品，可快速控制血浆中尿酸的浓度，降低病人在化疗中出现肿瘤溶解综合症的风险。Bertrand Coiffier等人在2001
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2002年对100位患有恶性非霍奇金淋巴瘤的病人在化疗中使用了重组尿酸氧化酶，用来检测尿酸氧化酶在第一轮化疗过程中对预防肿瘤溶解综合症的效果和其使用的安全性，实验证明尿酸氧化酶可以有效地控制血液中尿酸的含量，在预防和治疗患有恶性非霍奇金淋巴瘤肿瘤溶解综合症中起到了很好的作用。
[0004]拉布立酶(Rasburicase)是由法国Sanofi Synthelabo公司研发的重组尿酸酶，该酶来源于黄曲霉，通过酵母表达系统产生，于2002年7月被美国FDA批准上市，用于治疗和预防具有高危肿瘤溶解综合症的血液恶性肿瘤病人的急性高尿酸血症。然而，国外采用酿酒酵母来表达生产重组黄曲霉尿酸氧化酶，相对于酵母的长发酵周期和复杂的工艺控制，其13％的表达水平并不理想，从而导致了最终产品的价格居高不下。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决现有技术中使用酿酒酵母生产重组黄曲霉尿酸氧化酶时，发酵周期较长并且工艺控制复杂，蛋白表达水平不理想，从而导致了最终产品的价格居高不下的技术问题，提供一种大肠杆菌表达重组尿酸氧化酶的发酵方法。本专利技术的方法是将大肠杆菌基因工程菌经一级种子培养、二级种子培养、种子罐培养、发酵罐培养4个阶段生产重组尿酸氧化酶的发酵工艺，该工艺具有发酵周期短，蛋白表达量高的优点。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]本专利技术提供一种大肠杆菌表达重组尿酸氧化酶的发酵方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1、一级种子培养
[0009]1.1配制以下一级种子培养基
[0010]酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠5～10g/L；
[0011]1.2菌种复苏
[0012]将硫酸卡那霉素溶液加入到一级种子培养基中，再将大肠杆菌基因工程菌加至一级种子培养基中，在36～38℃，160～220rpm的恒温振荡器内培养4～9h，培养至OD
600 1.5～3.5，得到一级种子液；
[0013]步骤2、二级种子培养
[0014]2.1配制以下二级种子培养基
[0015]酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠5～10g/L；
[0016]2.2菌种传代
[0017]将硫酸卡那霉素溶液加入到二级种子培养基中，再将步骤1的一级种子液加至二级种子培养基中，在36～38℃，160～220rpm的恒温振荡器内培养4～9h，培养至OD
600
1.5～3.5，得到二级种子液；
[0018]步骤3、种子罐培养
[0019]3.1配制以下种子罐培养基
[0020]胰蛋白胨15～20g/L，酵母抽提物5～10g/L，氯化钠5～10g/L，氯化铵0.5～1g/L，七水合硫酸镁0.5～1g/L，氯化钙0.3～0.7g/L，葡萄糖3～7g/L，磷酸二氢钾1.5～2.5g/L，磷酸氢二钾10～20g/L；
[0021]其中氯化钙溶液和葡萄糖溶液分别单独配制；
[0022]3.2种子罐培养
[0023]将步骤2的二级种子液接种至种子罐培养基中，同时将氯化钙溶液、葡萄糖溶液一并接入种子罐培养基，定容；
[0024]初始参数：36～38℃、通气比为0.5vvm，溶氧100％，转速200rpm，罐压0.04MPa；
[0025]发酵过程中的参数控制：使用25％氨水调节pH至7.0，转速200～600rpm，通气比0.5～2.0vvm，pH7.0
±
0.05，温度36～38℃；溶氧维持10％～40％，调控过程中先调转速，调至最大值；再增加通气比，至通气比到最大值2.0vvm；罐压维持在0.04MPa；培养3～5h，培养至OD
600
达到8～10，得到三级种子液；
[0026]4、发酵罐培养
[0027]4.1配制以下发酵罐培养基
[0028]胰蛋白胨10～20g/L，酵母抽提物10～20g/L，氯化钠5～10g/L，氯化铵0.5～1g/L，氯化钙0.3～0.7g/L，七水合硫酸镁0.5～1g/L，磷酸二氢钾1.5～2.5g/L，磷酸氢二钾10～20g/L；
[0029]4.2配制碳源
[0030]葡萄糖：30～60g/L，纯化水或注射用水定容；
[0031]4.3配制氮源
[0032]胰蛋白胨10～15g/L，酵母抽提物10～15g/L，七水合硫酸镁0.2～0.6g/L，氯化钠3～7.5g/L，氯化铵0.5～1g/L；
[0033]4.4发酵罐培养
[0034]将步骤3的三级种子液转移至发酵罐培养基中；
[0035]发酵初始参数：36～38℃、通气比为0.5vvm，溶氧100％，转速200rpm，罐压0.04MPa；
[0036]发酵过程中的参数控制：使用25％氨水调节pH至7.0，转速200～500rpm，通气比0.5～2.0vvm，pH7.0
±
0.05，温度36～38℃；溶氧维持10％～40％，调控过程中先调转速，调至最大值；再增加通气比，至通气比到最大值2.0vvm；罐压维持在0.04MPa；发酵0h～6h，碳源每小时以50mL/min～150mL/min补加到发酵罐中，诱导后补加氮源，诱导0h～4h，氮源每小时以80mL/min～130mL/min补加到发酵罐，以溶氧恒定的方式进行补料；培养至OD
600
达到10～14，加入IPTG诱导，IPTG的终浓度为1mmol/L，诱导2～4h，发酵结束，共发酵4～6小时。
[0037]在上述技术方案中，优选的是，步骤1.2中将浓度为100mg/mL的硫酸卡那霉素溶液加入到一级种子培养基中至硫酸卡那霉素的终浓度为100μg/mL。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌表达重组尿酸氧化酶的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、一级种子培养1.1配制以下一级种子培养基酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠5～10g/L；1.2菌种复苏将硫酸卡那霉素溶液加入到一级种子培养基中，再将大肠杆菌基因工程菌加至一级种子培养基中，在36～38℃，160～220rpm的恒温振荡器内培养4～9h，培养至OD
600 1.5～3.5，得到一级种子液；步骤2、二级种子培养2.1配制以下二级种子培养基酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠5～10g/L；2.2菌种传代将硫酸卡那霉素溶液加入到二级种子培养基中，再将步骤1的一级种子液加至二级种子培养基中，在36～38℃，160～220rpm的恒温振荡器内培养4～9h，培养至OD
600
1.5～3.5，得到二级种子液；步骤3、种子罐培养3.1配制以下种子罐培养基胰蛋白胨15～20g/L，酵母抽提物5～10g/L，氯化钠5～10g/L，氯化铵0.5～1g/L，七水合硫酸镁0.5～1g/L，氯化钙0.3～0.7g/L，葡萄糖3～7g/L，磷酸二氢钾1.5～2.5g/L，磷酸氢二钾10～20g/L；其中氯化钙溶液和葡萄糖溶液分别单独配制；3.2种子罐培养将步骤2的二级种子液接种至种子罐培养基中，同时将氯化钙溶液、葡萄糖溶液一并接入种子罐培养基，定容；初始参数：36～38℃、通气比为0.5vvm，溶氧100％，转速200rpm，罐压0.04MPa；发酵过程中的参数控制：使用25％氨水调节pH至7.0，转速200～600rpm，通气比0.5～2.0vvm，pH7.0
±
0.05，温度36～38℃；溶氧维持10％～40％，调控过程中先调转速，调至相应罐最大值；再增加通气比，至通气比到最大值2.0vvm；罐压维持在0.04MPa；培养3～5h，培养至OD
600
达到8～10，得到三级种子液；步骤4、发酵罐培养4.1配制以下发酵罐培养基胰蛋白胨10～20g/L，酵母抽提物10～20g/L，氯化钠5～10g/L，氯化铵0.5～1g/L，氯化钙0.3～0.7g/L，七水合硫酸镁0.5～1g/L，磷酸二氢钾1.5～2.5g/L，磷酸氢二钾10～20g/L；4.2配制碳源葡萄糖：30～60g/L，纯化水或注射用水定容；4.3配制氮源胰蛋白胨10～15g/L，酵母抽提物10～15g/L，七水合硫酸镁0.2～0.6g/L，氯化钠3～7.5g/L，氯化铵0.5～1g/L；
4.4发酵罐培养将步骤3的三级种子液转移至发...

【专利技术属性】
技术研发人员：李士伟，宗贵宾，李梦，李博，李佳俊，崔静，张玉娜，赵春雨，丛天生，李傅霞，王旭，张峰，
申请(专利权)人：长春圣金诺生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：