一种重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法技术

本发明专利技术涉及一种重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法，涉及生物技术领域。本发明专利技术的一种重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法，是以配方为脱脂奶粉100.00

【技术实现步骤摘要】
一种重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法。

技术介绍

[0002]菌种资源是人类的宝贵资源，国内外研究机构对菌种保藏都给予极大的关注，菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有形状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。菌种保藏的原理是根据生理生化特性，人为创造条件尽量降低生物体内的代谢活动，以达到延长生命、减少变异的目的。在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，因此菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的，其中低温可减缓机体细胞的酶活，降低新陈代谢，达到保藏菌种的目的，同时会导致菌体诱发菌丝自溶机制。无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等；其次，应根据微生物生理、生化特点，人为的创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态；这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。
[0003]目前常用的菌种保藏方法为液氮超低温保藏法、真空冷冻干燥保藏法、定期移植法、矿物油保藏法等。部分研究表明前两种方法保藏效果较好，适合菌种长期保藏。然而仍存在着问题，例如即便是同一物种的蛹虫草，不同研究人员使用相似的方法，得出的结论却不尽相同。同时，液氮超低温保藏法和真空冷冻干燥保藏法，需要良好的设备及技术，投入过高，不能广泛应用于生产；后两种方法虽然简单、价廉，但占据的保藏空间较大，且由于转管次数过多，变异的可能性增大，极易造成菌种退化，给生产带来损失。因此，探讨高效廉价、操作简单的菌种保藏方式非常必要，从而获得更加科学和实用的结果。基于以上原因急需研究一种操作简单实用、保藏时间长、菌种质量稳定可靠、保藏成本低的大肠杆菌菌种保藏方法。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题是提供一种操作简单实用、保藏时间长、菌种质量稳定可靠、保藏成本低的重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法。本专利技术采用一种专用的冻干保护剂配方保存菌种，并进行冻干程序保存，通过复苏菌种检测表达量，诱导0h、1h、2h及3h的蛋白表达量依次为3.2％、41.5％、50.2％、56％。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案具体如下：
[0006]本专利技术的一种重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法，包括以下步骤：
[0007]步骤1、材料准备
[0008]冻干保护剂配制：
[0009]冻干保护剂配方：脱脂奶粉100.00
±
0.50g/L、海藻糖20.00
±
0.50g/L、蔗糖30.00
±
0.50g/L、谷氨酸钠15.00
±
0.50g/L；
[0010]按照上述配方配制冻干保护剂，密封，于2
‑
8℃保藏；
[0011]50％甘油配置：
[0012]按照甘油与水体积比为1:1量取，配制得到50％甘油，高温灭菌，备用；
[0013]步骤2、菌种复苏、传代
[0014]使用抗生素浓度为100μg/mL的LB培养基进行重组大肠杆菌菌种复苏和传代，将重组大肠杆菌菌种进行复苏，按比例接种，培养时间为10
‑
18h，采用革兰氏染色法进行镜检，若发生污染则立即停止；
[0015]传二代种，按照比例接种，培养时间为4
‑
9h，镜检同复苏过程；
[0016]传三代种，按照比例接种，培养时间为10
‑
18h，镜检同复苏过程；
[0017]传四代种，按照比例接种，培养时间为2
‑
4h，镜检同复苏过程，采用吸光度法对菌种活力进行检测，达到所要求的OD600值在0.6～1.0；
[0018]步骤3、甘油菌分装
[0019]按体积比1:1依次抽取50％甘油和步骤2的菌液加入到冻存管中，盖紧冻存管瓶盖，上下翻转，使其充分混匀；
[0020]步骤4、冻干菌分装
[0021]先将步骤3的菌液置于离心机中离心，抽取步骤1配制的冻干保护剂于离心管中，使其与菌体充分混匀，目测没有沉淀，按比例倒入冻干保护剂1:1定容，上下摇晃使其充分混匀，用移液枪抽取菌液分装于已灭菌西林瓶中，分装后半加塞方式加上已灭菌胶塞，转入铝盒并放入已灭菌的呼吸袋中，用封口机封口；
[0022]步骤5、菌种冻干
[0023]依次按照以下程序对步骤4的菌种进行冻干处理：
[0024]预冻期：在
‑
50℃维持2.5小时以上；
[0025]一次干燥：真空度为12
‑
17e
‑2mbar，温度从
‑
50℃逐渐升至25℃，时间为15～18h；
[0026]解析干燥：在真空度为0.1
‑
2e
‑2mbar，温度为25℃的条件下保持6
‑
8h；
[0027]步骤6、菌种保藏
[0028]将步骤5获得的菌种包装，贴上标签，置于
‑
80℃保存。
[0029]在上述技术方案中，优选的是，步骤1中配制的冻干保护剂使用前需高温灭菌。
[0030]在上述技术方案中，优选的是，步骤2中复苏过程按照菌液与培养基体积比1:250
ꢀ‑
1:500接种。
[0031]在上述技术方案中，优选的是，步骤2中传二代种过程中按照菌液与培养基体积比1:500
‑
1:1000接种。
[0032]在上述技术方案中，优选的是，步骤2中传三代种过程中按照菌液与培养基体积比1:500
‑
1:1000接种。
[0033]在上述技术方案中，优选的是，步骤2中传四代种过程中按照菌液与培养基体积比1:250
‑
1:1000接种。
[0034]在上述技术方案中，优选的是，步骤4中离心具体为8000rpm离心5min。
[0035]本专利技术的有益效果是：
[0036]本专利技术的一种重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法，是以配方为脱脂奶粉100.00
±
0.50g/L、海藻糖20.00
±
0.50g/L、蔗糖30.00
±
0.50g/L和谷氨酸钠15.00
±
0.50g/L作为冻干保护剂保存菌种，并采用甘油保藏，通过优化冻干过程的工艺参数，获得的一种冻干保藏方法，该方法具有操作简单实用、保藏时间长、菌种质量稳定可靠、保藏成本低的优点。本专利技术的方法保藏的重组大肠杆菌菌种通过复苏菌种检测表达量，诱导0h、1h、2h及3h的蛋白表达量依次为3.2％、41.5％本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、材料准备冻干保护剂配制：冻干保护剂配方：脱脂奶粉100.00
±
0.50g/L、海藻糖20.00
±
0.50g/L、蔗糖30.00
±
0.50g/L、谷氨酸钠15.00
±
0.50g/L；按照上述配方配制冻干保护剂，密封，于2
‑
8℃保藏；50％甘油配制：按照甘油与水体积比为1:1量取，配制得到50％甘油，高温灭菌，备用；步骤2、菌种复苏、传代使用抗生素浓度为100μg/mL的LB培养基进行重组大肠杆菌菌种复苏和传代，将重组大肠杆菌菌种进行复苏，按比例接种，培养时间为10
‑
18h，采用革兰氏染色法进行镜检，若发生污染则立即停止；传二代种，按照比例接种，培养时间为4
‑
9h，镜检同复苏过程；传三代种，按照比例接种，培养时间为10
‑
18h，镜检同复苏过程；传四代种，按照比例接种，培养时间为2
‑
4h，镜检同复苏过程，采用吸光度法对菌种活力进行检测，达到所要求的OD600值在0.6～1.0；步骤3、甘油菌分装按体积比1:1依次抽取50％甘油和步骤2的菌液加入到冻存管中，盖紧冻存管瓶盖，上下翻转，使其充分混匀；步骤4、冻干菌分装先将步骤3的菌液置于离心机中离心，抽取步骤1配制的冻干保护剂于离心管中，使其与菌体充分混匀，目测没有沉淀，按比例倒入冻干保护剂1:1定容，上下摇晃使其充分混匀，用移液枪抽取菌液分装于已灭菌西林瓶中，分装后半加塞方式加上已灭菌胶塞，转入铝盒并...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉娜，郭文英，白冰，鞠蒙蒙，杜研，许乐，宗贵宾，李士伟，
申请(专利权)人：长春圣金诺生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：