一种用于大肠杆菌超声波转化的低温保护液及冻存方法技术

本发明专利技术公开了一种用于大肠杆菌超声波转化的低温保护液，由二甲基亚砜和氯化钙溶液组成，其中，氯化钙溶液的浓度为100mM。以及，公开了利用该低温保护液冻存大肠杆菌的方法，将生长到对数生长期后期的菌经离心收集菌体，依次用感受态洗涤液、低温保护液洗涤，再重悬于低温保护液，移装至灭菌的转化容器中，

【技术实现步骤摘要】
一种用于大肠杆菌超声波转化的低温保护液及冻存方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种用于大肠杆菌超声波转化的低温保护液，以及利用该低温保护液冻存大肠杆菌的方法。

技术介绍

[0002]质粒转化大肠杆菌是分子生物学中最基本常用的技术，是现代生物研究的基础，具体指将外源质粒导入大肠杆菌细胞。近代以来，研究人员研究开发了多种实现大肠杆菌转化的技术，如热激转化、电转，接合转移等。2007年，Song等提供了一种超声波转化细菌的技术[Song,Y.,et al.,Ultrasound
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mediated DNA transfer for bacteria.Nucleic Acids Res,2007.35(19):p.e129.]，可利用超声波将质粒转入大肠杆菌、假单胞菌等细胞内。2010年，该转化方法的应用范围得到了扩展，革兰氏阳性菌也能利用该方法进行转化[Lin,L.,et al.,Ultrasound
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mediated DNA transformation in thermophilic gram
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positive anaerobes.PLoS One,2010.5(9):p.e12582.]。
[0003]然而，每次的超声波感受态细胞制备，都需要经历菌种划线活化、转接种子液、种子液扩大培养、多次离心清洗细胞等步骤，总时间大约需要40小时(其中，劳动时间至少2小时)。如能对感受态细胞实现低温冷冻保存，制备一批后冻存备用，随用随取，将极大方便、促进超声波转化的应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的第一目的是提供一种用于大肠杆菌超声波转化的低温保护液，感受态细胞在该低温保护液冻存下，超声波转化仍然保持着较高的转化率，适合批量制备感受态细胞，减少前期感受态细胞制备耗用的时间，提高超声波转化效率，制备一批后冻存备用，随用随取，将极大方便、促进超声波转化的应用。
[0005]本专利技术的第二目的是提供一种利用上述低温保护液冻存大肠杆菌的方法，将感受态细胞置于低温保护液冻存，转化时可直接取出感受态细胞进行超声波转化，既保持较高的转化率，又提高了转化效率，随用随取，将极大方便、促进超声波转化的应用。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]本专利技术公开了一种用于大肠杆菌超声波转化的低温保护液，由二甲基亚砜和氯化钙溶液组成。
[0008]在本专利技术的另一实施例中，所述的氯化钙溶液的浓度为100mM。
[0009]在本专利技术的一实施例中，所述的二甲基亚砜与所述的氯化钙的体积比为1:99～10:90。
[0010]在本专利技术的另一实施例中，所述的二甲基亚砜与所述的氯化钙的体积比为5:95。
[0011]本专利技术还公开一种利用上述的低温保护液冻存大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
[0012](1)将生长到对数生长期后期的菌经离心收集菌体，依次用感受态洗涤液、低温保护液洗涤；
[0013](2)再重悬于低温保护液，移装至灭菌的转化容器中，
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75～
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85℃冻存待用。
[0014]在本专利技术的一实施例中，所述的感受态洗涤液为经高压灭菌的100mM CaCl2溶液。
[0015]在本专利技术的一实施例中，所述的低温保护液为经高压灭菌的上述的低温保护液，其中，CaCl2溶液的浓度为100mM。
[0016]在本专利技术的一另实施例中，步骤(2)冻存温度为
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80℃。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0018]本专利技术的一种用于大肠杆菌超声波转化的低温保护液，将感受态细胞置于该低温保护液冻存，取出在超声波转化仍然保持着较高的转化率，冻存1个月后，超声波转化效率仍达到2
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106CFU/μg。特别适合批量制备超声波感受态细胞，减少前期制备感受态细胞所耗用的时间，可提高超声波转化的效率，制备一批感受态细胞后冻存备用，随用随取，将极大方便、促进超声波转化的应用。此外，该低温保护液的原料易取、成本低，制备简单，仅需二甲基亚砜和氯化钙即可制得。
附图说明
[0019]图1为本专利技术的大肠杆菌超声波转化后，涂布于平板在37℃温育培养的示意图；
[0020]图2为本专利技术的实施例2二甲基亚砜低温保护液对超声波感受态细胞的保护效果测试示意图，其中，横坐标为二甲基亚砜与氯化钙溶液的体积比，纵坐标为转化率；
[0021]图3为本专利技术的实施例3乙二醇低温保护液对超声波感受态细胞的保护效果测试示意图，其中，横坐标为二甲基亚砜与氯化钙溶液的体积比，纵坐标为转化率；
[0022]图4为本专利技术的实施例4甘油低温保护液对超声波感受态细胞的保护效果测试示意图，其中，横坐标为二甲基亚砜与氯化钙溶液的体积比，纵坐标为转化率。
具体实施方式
[0023]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应该理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用于限定本专利技术的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本专利技术做出的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。
[0024]低温保存技术是长期保存细胞活力的常规技术。为了促进超声波转化的实际应用，本专利技术研发了一种用于大肠杆菌超声波转化的低温保护液，目标是经历长时间冻存后，感受态细胞仍然保持较高的转化率。
[0025]待选溶剂有二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、乙二醇(Ethylene glycol，EG)和甘油(丙三醇，Glycerol)。我们采用的策略是利用不同比例的上述溶剂与氯化钙溶液(100mM)进行配比，制备低温保护液冻存感受态细胞，测定冻存一段时间后感受态细胞超声波转化的转化率。
[0026]一、测试方法
[0027]1、溶液配置
[0028]1.1感受态洗涤液：经高压灭菌的100mM CaCl2溶液。
[0029]1.2低温保护液：100mM CaCl2溶液加入一定体积的DMSO、甘油或乙二醇，再经高压灭菌。
[0030]2、感受态细胞的制备
[0031]2.1将生长到对数生长期后期的菌经离心收集菌体，依次用感受态洗涤液洗涤2次、低温保护液洗涤1次；
[0032]两次感受态洗涤液清洗后，在低温保护液重悬前，增加了一次低温保护液清洗，保证低温保护液是最终感受态细胞的冻存环境。
[0033]2.2再重悬于低温保护液，移装至灭菌的转化容器中，
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75～
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85℃冻存待用。
[0034]3、感受态细胞超声波转化
[0035]3.1将0.3微升pUC18质粒(317.9ng/μl)放入100μl感受态细胞中，轻柔吹打混匀；
[0036]3.2将混合体系加入超声容器中，放入超声波清洗机进行超声处理，处理时均在超声波清洗机中心位置，转化条件：25℃，28KHz，80W，超声处理10s；
[0037]3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于大肠杆菌超声波转化的低温保护液，其特征在于，由二甲基亚砜和氯化钙溶液组成。2.根据权利要求1所述的低温保护液，其特征在于，所述的氯化钙溶液的浓度为100mM。3.根据权利要求2所述的低温保护液，其特征在于，所述的二甲基亚砜与所述的氯化钙溶液的体积比为1:99～10:90。4.根据权利要求3所述的低温保护液，其特征在于，所述的二甲基亚砜与所述的氯化钙的体积比为5:95。5.一种利用权利要求1所述的低温保护液冻存大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将生长到对数生长期后期的菌经离心收集菌体，依次用感受态洗涤液、低温保护...

【专利技术属性】
技术研发人员：高义舟，张萌，菲利普，
申请(专利权)人：中国科学院上海巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：