用于监测毒性的微生物的冻存和复苏方法及其在食品水质监测中的应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了用于监测毒性的微生物的冻存和复苏方法，以获得保存周期长、性能稳定、快速复苏的冻干粉，能够应用于食品水质有害物质的检测。食品水质有害物质的检测。

【技术实现步骤摘要】
用于监测毒性的微生物的冻存和复苏方法及其在食品水质监测中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及用于监测毒性的微生物的冻存和复苏方法及其在食品水质监测中的应用。

技术介绍

[0002]哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是海洋中一种发光的革兰氏阴性菌，菌体呈弧状或短杆状，有侧生鞭毛，嗜盐菌。哈维氏弧菌可以在水生环境中独立生存，也可作为海生动物的正常寄生菌。哈维氏弧菌在无盐培养基中不生长，在含盐营养琼脂平板上生长良好。其中在TCBS平板上生长，菌落呈黄色圆形，且不透明；在普通琼脂培养基上为灰白色圆形。它广泛分布于水生环境中，是引起海洋生物发光性弧菌病的重要病原菌。
[0003]环境监测中使用的发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响，毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关，即毒性物质毒性越强，则发光抑制越明显。海洋发光菌应用于海洋生态环境监测具备成本低、简单便捷等特点，备受科研工作者关注，近年来发展迅敏。海洋发光细菌根据其DNA相似程度可分为五大类，包括哈维氏弧菌、费氏弧菌、发光杆菌、羽田西瓦氏菌和创伤弧菌。国内外在海洋发光菌应用中，明亮发光杆菌在环境污染检测方面的应用研究最多，而对于其他菌株研究较少。不同菌株之间存在生物学性质的差异，培养、复壮等条件迥异，很难有借鉴作用。
[0004]发光细菌法中的发光细菌在监测中通常以菌液和冻干粉等形式出现。菌液的保藏难度大，而且在进行检测时，一般是要将发光细菌离心去除培养基后才能使用，耗时长，而且离心的过程会对细菌的活性造成一定的影响。冻干粉是经历了低温干燥后制成的，常温下可以进行短时间的运输，保存时间长，在
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20℃的条件下能够保存3
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9个月，但是其存在复苏后发光稳定性不强，发光效率下降等缺陷。发光菌的冻干粉比一般菌株冻干粉要求更高，需要具备以下几个特点：菌株死亡率低、活力高；能够快速复苏达到高活力状态；复苏液中组分尽可能简单可控，避免给检测结果造成影响。
[0005]如何发光菌进行冻存和活化培养是测定的关键步骤。对于用相对发光强度来检测物质毒性的方法来说，其对于发光强度的要求相对严格，要确保发光强度在一定的时间内保持相对稳定，并要尽量延长其使用寿命。目前，鲜有关于哈维氏弧菌冻存、活化的研究，仅有少数文献报道了哈维氏弧菌的培养。
[0006]文献1：海洋发光细菌发光最优培养基筛选的研究，吴自荣等，华东师范大学学报；把包括明亮发光杆菌、哈维氏弧菌等在内的五种发光细菌在不同培养基条件下振荡培养，在培养的不同时间里取样测定发光强度；实验结果表明，对所试验过的五种发光细菌都有对本身发光最有利的培养基，对培养基的成份要求也不尽相同。
[0007]文献2：单增李斯特菌群体感应抑制剂的筛选及控制效应研究，吴雅茜，广东海洋大学，通过LB液体培养基对哈维氏弧菌进行37℃摇床培养。
[0008]文献3：CN110590918A公开了哈维氏弧菌ATCC BB
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170以1％接种量(v/v)接种于LB
肉汤培养基中，30℃静置培养24h，传代2次后，以1.0％接种量(v/v)接种于LB肉汤培养基，30℃培养12h，来实现细胞增殖培养。
[0009]但是上述文献没有公开具体冻存和复苏方法对菌株哈维氏弧菌增殖活力和发光强度的影响。对于其他发光菌的冻存粉，现有技术有一些报道。例如：
[0010]文献4：基于群体感应系统的发光细菌水质毒性快速检测法的研究，王琳，重庆大学硕士学位论文，记载了：为了改善费氏弧菌冻干粉的复苏效果，对冻干粉的复合冷冻保护剂进行了研究，发现由15％脱脂乳、5％甘油、12.5％海藻糖溶于水后制成的复合冷冻保护剂能够有效的使细菌在经历了冷冻干燥过程后生存下来，在此冷冻保护剂的保护下，冻干粉能够在
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20℃条件下至少保存6个月；复苏时间从传统的15
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30min缩短到5min，大大提高监测效率。但是，不同菌株之间存在理化性质的差异，专利技术人将该复合冷冻保护剂应用到哈维氏弧菌，其冻干粉能够在
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20℃条件下保存仅为3个月，而且复苏的细胞存活率仅为40
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50％，而且发光活力恢复时间需要20min以上，无法满足实际需求。
[0011]文献5：CN 111979140 A，公开了将明亮发光杆菌液和冻干保护剂(重量份：脱脂奶粉10％，蔗糖8％，谷氨酸钠1％，溶剂为无菌水)按照1：1的体积比混匀，装于西林瓶中；60min内降温至
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70℃，冻存12h，然后置于
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40℃条件下，真空冷冻干燥得到冻干粉，最后放置于在
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20℃条件下保存。但是采用上述冻存方法对哈维氏弧菌进行冻存，其冻干粉能够在
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20℃条件下保存为6个月以内，而且复苏的细胞存活率为50％左右，同样无法达到工业化应用的要求。

技术实现思路

[0012]针对现有技术存在的不足，需要针对哈维氏弧菌开发特定的冻存方法，以获得保存周期长、性能稳定、快速复苏的冻干粉，能够应用于食品水质有害物质的检测。
[0013]本专利技术是通过如下技术方案来实现的。
[0014]用于监测毒性的微生物的冻存和复苏方法，包括如下步骤：
[0015]1)哈维氏弧菌株活化后接种至LB液体培养基，培养至密度为(1
‑
10)
×
108cfu/ml，然后在高速离心机中离心，去除上清，收集菌体，按照1
‑
2:1
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2的体积比例添加冻存液，混匀，分装到冻存管中，每管1ml，在
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50℃下预冻0.5
‑
2h后放入真空冷冻干燥机，干燥1
‑
10h得到冻干粉，封管口，并在
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20℃下长期保存；
[0016]2)向每支冻干粉中加入5
‑
10ml的NaCl水溶液中，轻轻震荡，使其完全溶解复苏。
[0017]作为具体的实施例中，
[0018]所述冻存液包括脱脂乳、尿素和透明质酸钠，溶剂为水。
[0019]在更具体的实施例中，
[0020]所述冻存液包括脱脂乳10％+尿素5％+透明质酸钠5％，以上为质量比，溶剂为水。
[0021]在优选的实施例中，
[0022]所述冻存液的组分为：脱脂乳10％+尿素5％+透明质酸钠5％，以上为质量比，溶剂为水。
[0023]在更优选的实施例中，
[0024]所述冻存液的组分为：脱脂乳10％+尿素5％+透明质酸钠5％+硝酸镧0
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0.01％，以上为质量比，溶剂为水。
[0025]在更优选的实施例中，
[0026]所述冻存液的组分为：脱脂乳10％+尿素5％+透明质酸钠5％+硝酸镧0.005％，以上为质量比，溶剂为水。
[0027]在最优选的实施例中，
[0028]所述冻存本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于监测毒性的微生物的冻存和复苏方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)哈维氏弧菌株活化后接种至LB液体培养基，培养至密度为(1
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10)
×
108cfu/ml，然后在高速离心机中离心，去除上清，收集菌体，按照1
‑
2:1
‑
2的体积比例添加冻存液，混匀，分装到冻存管中，每管1ml，在
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50℃下预冻0.5
‑
2h后放入真空冷冻干燥机，干燥1
‑
10h得到冻干粉，封管口，并在
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20℃下长期保存；2)向每支冻干粉中加入5
‑
10ml的NaCl水溶液中，轻轻震荡，使其完全溶解复苏。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冻存液包括脱脂乳、尿素和透明质酸钠，溶剂为水。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冻存液包括脱脂乳10％+尿素5％+透明质酸钠5％，以...

【专利技术属性】
技术研发人员：张澜，杨琳，
申请(专利权)人：日照市质量检验检测研究院，
类型：发明
国别省市：