一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂及其制备方法和使用方法技术

本发明专利技术提供了一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂及其制备方法和使用方法，属于病原微生物菌种保藏技术领域。本发明专利技术提供的美人鱼发光杆菌冻干保护剂，包括如下组分：脱脂乳、脱纤维羊血、海藻糖、乳糖和聚乙烯吡咯烷酮。本发明专利技术通过对冻干保护剂配比、制备方法和对病原菌冷冻干燥方法进行优化，实现了对美人鱼发光杆菌的长期保藏，最大限度减少了菌体在冻干和复苏过程中的死亡率，并可保持强致病性美人鱼发光杆菌的溶血性能稳定不变，为深远海养殖鱼类临床分离菌株的保藏提供了新的途径。离菌株的保藏提供了新的途径。离菌株的保藏提供了新的途径。

【技术实现步骤摘要】
一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂及其制备方法和使用方法


[0001]本专利技术涉及病原微生物菌种保藏
，尤其涉及一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂及其制备方法和使用方法。

技术介绍

[0002]作为当下最有效的微生物资源长期稳定保藏技术，真空冷冻干燥技术在多种微生物种质资源保藏中得以广泛应用。但由于不同微生物的生理代谢需求、生境条件、遗传稳定性等方面存在较大差异，针对不同类别和具有典型功能特性的微生物的冻干保存方法也不尽相同。同时，细菌在冻干过程中所经历的冷冻和干燥过程均会对细菌菌体产生较大的胁迫作用和结构损伤，冻干技术不当将导致细胞膜破裂、细胞质外流、质粒丢失、染色质断裂等现象的发生，进而引起细胞生理代谢和遗传信息的改变，甚至导致细胞死亡。
[0003]美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.damselae)又称美人鱼弧菌(Vibrio damsela)，隶属于弧菌科，是美人鱼发光杆菌仅有的两个亚种之一。自Love等首次在美国加利福尼亚州患病斑鳍光鳃鱼(Chromispunctipinnis)皮肤病灶分离并鉴定以来，在美国、欧洲、日本、韩国等地区均有关于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种可致海水动物(包括鲸豚类等海洋哺乳动物)患病的报道，并逐渐成为该地区海水养殖常见病原菌(Sharma et al.,2017)。美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染引发的水生动物疾病表现为体表溃烂严重、传染速度快、死亡率高、难治愈等特点。此外，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种可感染引发人类患病，病症主要包括流脓、败血症、肌膜炎等，发病后患者通常表现为体表溃烂或脓毒症，甚至危及生命安全(Yamane et al.,2004)。
[0004]美人鱼发光杆菌美人鱼亚种通过表达一系列的毒力因子实现对宿主的感染和在宿主内存活。Rivas等在2011年首次报道了美人鱼发光杆菌美人鱼亚种重要毒性质粒pPHDD1上的溶血素基因Damselysin(Dly)和Phobalysin P(PhlyP或HlyApl)(Rivas et al.,2011)。目前，已系统研究和报道的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种毒力因子包括pPHDD1质粒编码的Dly、HlyApl和染色质编码的PhlyC(或HlyAch)和phospholipase(PlpV)(Rivas et al.,2015；Vences et al.,2017)。中国水产科学研究院黄海水产研究所对具有时空差异的多株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种比较分析表明，鱼类强致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株均含有毒性质粒，毒力基因分型为dly
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hlyApl
‑
hlyAch
‑
plpV(刘潇等，2021)。且不同毒力基因型的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株及其胞外产物对鱼类的致死率与毒力基因型呈正相关性(李永杰等，2022)。揭示了强致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的致病性是由质粒介导的毒力基因表达与胞外产物分泌的协同作用。
[0005]由于细菌质粒具有转导特性和遗传不稳定属性，为后续持续进行美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的生物学、病原学和致病机理等方面的研究，对含有毒性质粒的强致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种进行长期有效的保藏尤为迫切。因此，如何提供一种可以长期有效的保藏强致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂及其制备方法和使用方法。本专利技术通过对冻干保护剂配比、制备方法和对病原菌冷冻干燥方法进行优化，实现了对美人鱼发光杆菌的长期保藏，最大限度减少了菌体在冻干和复苏过程中的死亡率，并可保持强致病性美人鱼发光杆菌的溶血性能稳定不变，为深远海养殖鱼类临床分离菌株的保藏提供了新的途径。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂，包括如下组分：脱脂乳、脱纤维羊血、海藻糖、乳糖和聚乙烯吡咯烷酮。
[0009]优选的，以水为溶剂，包括如下浓度的组分：脱脂乳40～80g/L，脱纤维羊血10～40mL/L、海藻糖30～75g/L，乳糖25～60g/L，聚乙烯吡咯烷酮10～30g/L。
[0010]本专利技术还提供了一种上述冻干保护剂的制备方法，将海藻糖、乳糖和聚乙烯吡咯烷酮溶解后灭菌，得到溶液A；将脱脂乳溶解后灭菌，过滤，得到溶液B；将所述溶液A、溶液B与脱纤维羊血混合后，得到所述冻干保护剂。
[0011]优选的，所述过滤采用微孔滤膜进行，所述微孔滤膜的孔径为0.2～0.3μm。
[0012]本专利技术还提供了一种上述冻干保护剂的使用方法，将细菌悬液与上述冻干保护剂或上述制备方法制备的冻干保护剂混合后，经冷冻、冻干、密封。
[0013]优选的，所述细菌悬液的浓度为108～10
10
CFU/mL；所述细菌悬液与所述冻干保护剂的体积比为1：1～2。
[0014]优选的，所述冷冻的温度为
‑
80～
‑
60℃，时间为4～8h。
[0015]优选的，所述冻干的温度为
‑
45℃～
‑
25℃；真空度为0.1～0.4mbar，时间为20～24h。
[0016]优选的，所述密封是通过充入干燥二氧化碳，当气压达到0.09MPa时进行密封。
[0017]本专利技术提供了一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂及其制备方法和使用方法。本专利技术通过对冻干保护剂配比、制备方法和对病原菌冷冻干燥方法进行优化，实现了对美人鱼发光杆菌的长期保藏，最大限度减少了菌体在冻干和复苏过程中的死亡率，美人鱼发光杆菌冻干保存一年的存活率可高达59.1％，平均存活率可达50.8％，提高了对深远海养殖鱼类临床分离菌株的冻干复苏率。
[0018]本专利技术采用向冻干舱内充入高纯度干燥二氧化碳至常压后再进行密封，避免真空封时内外压力差导致的空气泄漏，同时在干燥二氧化碳的保护下，使得冻干菌粉的保藏时间更长，也防止因空气进入而导致的氧化变性。通过本专利技术的冻干保护剂搭配冷冻干燥方法，可保持强致病性美人鱼发光杆菌的致病性能稳定不变，为深远海养殖鱼类临床分离菌株的保藏提供了新的途径。
附图说明
[0019]图1为试验例1制备的美人鱼发光杆菌冻干菌粉外观图；
[0020]图2为试验例1中添加了冻干保护剂的美人鱼发光杆菌Pdd1605和Pdd0909冻干前后的溶血情况；
[0021]图3为试验例2制备的临床分离美人鱼发光杆菌冻干菌粉外观图；
[0022]图4为试验例2中添加了冻干保护剂的临床分离美人鱼发光杆菌冻干前后的溶血情况。
具体实施方式
[0023]下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0024]实施例1
[0025]本实施例制备了一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂，以水为溶剂，包括本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂，其特征在于，包括如下组分：脱脂乳、脱纤维羊血、海藻糖、乳糖和聚乙烯吡咯烷酮。2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，以水为溶剂，包括如下浓度的组分：脱脂乳40～80g/L，脱纤维羊血10～40mL/L、海藻糖30～75g/L，乳糖25～60g/L，聚乙烯吡咯烷酮10～30g/L。3.一种权利要求1或2所述的冻干保护剂的制备方法，其特征在于，将海藻糖、乳糖和聚乙烯吡咯烷酮溶解后灭菌，得到溶液A；将脱脂乳溶解后灭菌，过滤，得到溶液B；将所述溶液A、溶液B与脱纤维羊血混合后，得到所述冻干保护剂。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述过滤采用微孔滤膜进行，所述微孔滤膜的孔径为0.2～0.3μm。5.一种权利要求1或2所述的冻干保护剂或权利要求3或4任一项制备的冻干保护剂的使用方法，其特征在于，将...

【专利技术属性】
技术研发人员：于永翔，张正，王印庚，刘定远，王春元，廖梅杰，荣小军，李彬，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：