一种重组尿酸氧化酶的纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种重组尿酸氧化酶的纯化方法，解决现有氧化酶的纯化方法存在产品纯度低、活性低，质量有待提高的技术问题。本发明专利技术的重组尿酸氧化酶的纯化方法，交替应用互补层析技术，合理衔接三步纯化工艺，应用亲和层析、离子交换和分子筛层析方法纯化得到重组尿酸氧化酶原液，使生产成本降低，蛋白收率提高，并能进一步提高产品质量。本发明专利技术的纯化方法，纯化后的重组尿酸氧化酶蛋白原液RP

【技术实现步骤摘要】
一种重组尿酸氧化酶的纯化方法


[0001]本专利技术涉及一种纯化方法，具体涉及一种重组尿酸氧化酶的纯化方法。

技术介绍

[0002]尿酸氧化酶(Urate Oxidase，Uricase；EC1.7.3.3)是生物体内嘌呤代谢的关键酶，其可将不溶性的尿酸降解为可溶性尿囊素、二氧化碳和过氧化氢，并随之排出体外。尿酸在人体内的溶解度为11mg/100mLH2O，而尿囊素溶解度约为147mg/100mLH2O，是尿酸溶解度的13.5倍左右，因此将尿酸转化为尿囊素可以促使尿酸快速的溶解排出体内，从而降低人体内尿酸的含量。在生物体嘌呤代谢途径中，嘌呤降解生成尿酸的过程从原核生物到真核生物高度保守，大多数的生物体内都存在尿酸氧化酶，但在高等哺乳动物(猿和人类)体内却缺乏有生物学活性的尿酸氧化酶，而以尿酸作为嘌呤代谢的终产物。因此人体内血浆尿酸水平大约是非灵长类动物的10倍。尿酸及其盐类在血液中溶解度很低，如果体内嘌呤代谢紊乱，产生过量尿酸，或者尿酸排泄受阻，血液中尿酸浓度增高，形成高尿酸血症，长期尿酸过高就引起痛风。
[0003]目前，高尿酸血症已被列为心血管疾病的独立风险因素。控制痛风和治疗尿酸过高的药物都有诸多缺陷。秋水仙碱可以抑制痛风发作时的急性炎症反应，但是毒性巨大，且不能降低尿酸含量。丙磺舒、苯溴马隆等药物可以干扰肾小管对尿酸的重吸收，促进尿酸的排泄，但是对人体肾脏的损伤巨大，容易引发肾结石等肾病的发生。吲哚美辛等非甾体抗炎药可以缓解改善痛风引发的关节炎等症状，消除疼痛，但是无法长期服用，副作用巨大。别嘌呤醇等药物通过抑制黄嘌呤氧化酶活性，阻断尿酸的产生来降低尿酸，但是又增加了肾脏排泄尿酸前体的负荷，而且容易引发黄嘌呤肾病和结石。与上述药物相比，尿酸氧化酶UOX针对的直接药物靶点就是尿酸，能够快速降低人体血液中的尿酸浓度，而且还能催化肾脏和关节中的尿酸沉淀快速分解，能从根本上治疗高尿酸血症，副作用极低。尿酸氧化酶同时还能用于人体中尿酸含量的检测，能够迅速的检测出人体内尿酸的浓度。所以尿酸氧化酶不仅能用于临床治疗，也能用于临床的检测试剂应用。因此尿酸氧化酶是一种重要的医药用酶，有较高的市场价值。
[0004]尿酸氧化酶在自然界广泛存在，已经发现了多种来源的尿酸氧化酶，并对其理化性质进行了研究，发现天然来源的尿酸氧化酶由于受产酶条件及产酶水平的影响，而限制了其在商业化生产中的有效应用，因此，尿酸氧化酶的异源表达及纯化制备逐渐成为研究热点。已经有黄曲霉(A.flavus)、假丝酵母(Candida utilis)的尿酸氧化酶基因在大肠杆菌中进行了异源表达，并获得了有生物学活性的蛋白。如专利号为200410017948.4的中国专利公开了一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法，涉及的尿酸氧化酶的纯化方法为：(1)融合蛋白的分离、纯化：收集菌体，进行超声破碎，收集上清，目标蛋白主要存在破菌后上清液中，将收集到的上清用离子交换(CM)法分离纯化，梯度洗脱收集目标蛋白峰；(2)融合蛋白的酶切、纯化：将离子交换目标蛋白峰稀释后加入凝血酶酶切过夜，酶切后样品补加硫酸铵进行疏水层析(Phenly)，梯度洗脱收集目标蛋白峰，得到的疏水层析峰经过Sephadex G25
脱盐，即为精细纯化的尿酸氧化酶。该方法虽然获得了有生物学活性的蛋白，但是存在产品纯度低、活性低，质量有待提高的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决现有技术中的技术问题，提供一种重组尿酸氧化酶的纯化方法。本专利技术的纯化方法，交替应用互补层析技术，合理衔接三步纯化工艺，应用亲和层析、离子交换和分子筛层析方法纯化得到重组尿酸氧化酶原液，使生产成本降低，蛋白收率提高，并能进一步提高产品质量。本专利技术的纯化方法，纯化后的重组尿酸氧化酶蛋白原液RP
‑
HPLC纯度达98％，酶比活性达23EAU/mg，且纯化工艺简单，适合规模放大。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]本专利技术提供一种重组尿酸氧化酶的纯化方法，包括以下步骤：
[0008](1)菌体破碎
[0009]称取菌体，加入破菌液，将菌体搅拌至完全溶解，使用高压均质机，均质压力在500bar～600bar之间，均质两次，要求出液口温度10～15℃；
[0010]将上述获得的菌体溶液置于冷冻离心机离心，温度2～8℃，离心力不低于7500g，时间45
‑
50min，收集上清液，上清液使用滤膜过滤；
[0011](2)亲和层析富集融合蛋白
[0012]将过滤后的破菌上清液用稀释液稀释后调节pH值，以线性流速60～80cm/h上样至亲和层析柱，然后用亲和平衡液洗涤亲和层析柱至OD280接近基线，用亲和洗脱液以线性流速60～80cm/h洗脱，收集目标蛋白峰，获得初步纯化富集的融合尿酸氧化酶蛋白溶液；
[0013](3)酶切融合蛋白
[0014]将初步纯化富集的融合尿酸氧化酶蛋白溶液用酶切缓冲液稀释至浓度1.0mg/mL，调节至pH6.50
±
0.03，按肠激酶与稀释后的融合尿酸氧化酶蛋白溶液的体积比为1/1000～1/800加入肠激酶，2～8℃酶切过夜，调节pH8.00
±
0.03终止酶切；
[0015]所述酶切缓冲液为：20mMPB，10mMCaCl，1g/L GSH，pH6.5；
[0016](4)中度纯化重组尿酸氧化酶
[0017]将酶切后的蛋白溶液进行阴离子交换层析，用离子交换平衡液以线性流速60～80cm/h平衡5CV后上样，以OD280监测，收集流穿液为目标蛋白；
[0018](5)超滤浓缩离子交换洗脱峰
[0019]将离子交换层析洗脱峰进行超滤浓缩；
[0020](6)凝胶过滤层析精细纯化目标蛋白
[0021]用平衡液以线性流速40～60cm/h平衡层析柱后，上样超滤浓缩后的样品，用平衡液以线性流速40～60cm/h洗脱收集目标蛋白峰，即为纯化得到的高纯度重组尿酸氧化酶原液。
[0022]在上述技术方案中，优选的是，步骤(1)中所述破菌液为：20mMPB，0.1MNaCl，10g/L蔗糖，0.5％巯基乙醇，pH8.0。
[0023]在上述技术方案中，优选的是，步骤(1)中所述菌体与破菌液的质量体积比为1：8(Kg/L)。
[0024]在上述技术方案中，优选的是，步骤(1)中所述上清液使用0.45μm滤膜过滤。
[0025]在上述技术方案中，优选的是，步骤(2)中：所述稀释液为：20mMPB，0.1MNaCl，25mM咪唑，pH8.0；所述亲和平衡液为：20mMPB，0.1MNaCl，20mM咪唑，pH8.0；所述亲和洗脱液为：20mMPB，0.1MNaCl，150mM咪唑，pH8.0。
[0026]在上述技术方案中，优选的是，步骤(2)中将过滤后的破菌上清液用稀释液5倍稀释后调节pH8.0。
[0027]在上述技术方案中，优选的是，步骤(2)中上样至本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
sephrose Fast Flow或Q sepharose Fast Flow阴离子交换层析；所述离子交换平衡液为：20mMPB，1M尿素，10mMNaCl，pH8.0。9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(5)中将离子交换层析洗脱峰用截留分子量为10KD的超滤膜进行超滤浓缩。10....

【专利技术属性】
技术研发人员：李梦，宗贵宾，张玉娜，杜研，李士伟，王旭，李傅霞，袁秋艺，许乐，
申请(专利权)人：长春圣金诺生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：