普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用，本发明专利技术的改造方法通过组合突变设计出最佳突变体，对PtDAPDH的蛋白质进行改造，克服了之前野生型酶催化活性低的局限，最终得到最佳突变体T5(PtDAPDH

【技术实现步骤摘要】
普雷沃氏菌内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]D
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对羟基苯甘氨酸(D
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p
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hydroxyphenylglycine，D
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HPG)，又名4
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羟基苯甘氨酸，是一种具有手性中心的非天然氨基酸。D
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HPG是氨基酸生物合成的重要中间体，被广泛用于合成肽类激素和农药。特别是作为医药中间体，广泛用于制备β
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内酰胺类抗生素，如阿莫西林、氨羟苄头孢菌素和头孢哌酮等。该类抗生素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、致病螺旋体等均有良好的杀灭作用，并且具有副作用小、口服效果佳等优点。在临床上，β
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内酰胺类抗生素可用于治疗敏感菌引起的肺炎、菌血症、尿道炎等器官软组织感染。
[0003]目前，D
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HPG的主要生产方法为化学合成法和海因酶转化法，其中化学合成法主要为不对称转化法和化学拆分法，但是这些方法在不同程度上都存在反应条件苛刻、环境污染大、生产效率低以及生产成本高的问题；并且会对环境产生毒害作用，不符合绿色生产、安全生产和可持续发展的要求。目前酶转化法主要是海因酶法，由于酶催化剂具有特异性高、种类多样以及绿色环保的特点，酶转化法成为合成D
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HPG的重要技术手段；因此，越来越多的研究人员寻求利用酶转化法来合成D
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HPG。其中通过酮酸一步还原胺化制备手性D
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对羟基苯甘氨酸具有生产工艺条件温和、高效、环保等特点，可以减轻环境和资源压力，因此迫切需要一种高效制备D
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对羟基苯甘氨酸的生物法。
[0004]酮酸的一步还原胺化法生产D
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对羟基苯甘氨酸涉及到一个关键的酶内消旋二氨基庚二酸脱氢酶(meso
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DAPDH,meso
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Diaminopimelate Dehydrogenase，EC 1.4.1.16)，它具有较宽泛的底物谱，能够催化脂肪族酮酸和部分芳香族酮酸的还原胺化，使得在酮酸的α
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羰基还原胺化，形成对应的D
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氨基酸。
[0005]此外，多酶级联反应也是酶生物转化中的重要手段，具有许多优点。例如，它可以避开反应中间体的积累，利用廉价易得的原料作为反应的起始底物，并且多酶反应间的协同性可以通过调控酶之间的表达比例得以调节，从而解决了底物酮酸的昂贵或者不易获得的问题。常用的级联路径是将内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶(DAPDH)、L
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氨基酸氧化酶和葡萄糖脱氢酶偶联，L
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氨基酸氧化酶可以利用L
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对羟基苯甘氨酸为底物，催化L
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对羟基苯甘氨酸脱氨生成酮酸，再进一步经过DAPDH的还原胺化作用最终生成D
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对羟基苯甘氨酸，同时通过引入辅酶再生系统实现还原型辅酶NADPH的再生。
[0006]近几十年来，蛋白质工程已经成为在分子水平改善酶的性质的有效策略，如扩大底物范围、提高酶的活性和改善酶的稳定性的最有效的方法。因此，通过蛋白质工程设计PtDAPDH，可能解决其催化活性低的问题。蛋白质工程改造主要可以分四类：传统的定向进化(即非理性设计)、半理性设计、理性设计(基于结构与计算机技术)和多种策略的组合应用。目前，关于利用蛋白质工程改造PtDAPDH已经取得了一定的研究进展，然而，催化活性的改善效果仍然有限，远不能满足实际的工业化需求。

技术实现思路

[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种可以高效制备D
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对羟基苯甘氨酸的PtDAPDH突变体及其改造方法，并利用该突变体蛋白催化对羟基苯乙醛酸制备D
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对羟基苯甘氨酸，以及进一步将得到的突变体与L
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氨基酸氧化酶和葡萄糖脱氢酶偶联，以廉价底物L
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对羟基苯甘氨酸制备D
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对羟基苯甘氨酸。本专利技术所构建的菌株在D
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对羟基苯甘氨酸制备中具有高生产强度，高催化稳定性，减少了转化中的投菌量，极大节约了工业化的生产成本。
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶(PtDAPDH)突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第13位、第90位、第254位的氨基酸中的一个或多个进行突变。
[0009]进一步地，所述的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第13位天冬酰胺突变为谷氨酸，突变体命名为N13E。
[0011]进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第90位丝氨酸突变为精氨酸，突变体命名为S90R。
[0012]进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第254位脯氨酸突变为丙氨酸，突变体命名为P254A。
[0013]进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第13位天冬酰胺突变为谷氨酸，并将第90位丝氨酸突变为精氨酸，突变体命名为N13E/S90R。
[0014]进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第13位天冬酰胺突变为谷氨酸、第90位丝氨酸突变为精氨酸，及第254位脯氨酸突变为丙氨酸，突变体命名为N13E/S90R/P254A。
[0015]本专利技术的第二个目的是提供一种编码所述的普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶(PtDAPDH)突变体的基因。
[0016]本专利技术的第三个目的是提供一种包含所述的基因的表达载体。
[0017]进一步地，所述的表达载体以pRSFDuet为载体。
[0018]进一步地，所述的表达载体上还包含PmLAAD编码基因和BmGDH编码基因。
[0019]进一步地，所述的PmLAAD编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0020]进一步地，所述的BmGDH编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0021]本专利技术的第四个目的是提供一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第13位、第90位、第254位的氨基酸中的一个或多个进行突变。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本进行了如下突变：(1)第13位天冬酰胺突变为谷氨酸；或，(2)第90位丝氨酸突变为精氨酸；或，(3)第254位脯氨酸突变为丙氨酸；或，(4)第13位天冬酰胺突变为谷氨酸，并将第90位丝氨酸突变为精氨酸；或，(5)第13位天冬酰胺突变为谷氨酸、第90位丝氨酸突变为精氨酸，及第254位脯氨酸突变为丙氨酸。3.一种编码权利要求1或2所述的普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH突变体的基因。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴静，谭阳，刘立明，宋伟，陈修来，高聪，刘佳，周怡雯，郭亮，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：