亚胺还原酶突变体及其在合成(R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种亚胺还原酶突变体以及这种亚胺还原酶用于制备化合物I(R)

【技术实现步骤摘要】
亚胺还原酶突变体及其在合成(R)
‑2‑
(2，5
‑
二氟苯基)吡咯烷中的应用
[
][0001]本专利技术涉及医药化工领域，具体涉及一种亚胺还原酶突变体，以及这种亚胺还原酶突变体的应用，还涉及这种亚胺还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶的共表达酶以及这种共表达酶的应用。
[
技术介绍
][0002]拉罗替尼(Larotrectinib)，商品名是美国Bayer开发的抗肿瘤药物，用于成人和小儿具有神经营养受体酪氨酸激酶(NTRK)基因融合的实体瘤治疗，于2018年11月26日经FDA批准在美国上市。其特点在于：
①
不限癌种，只要存在NTRK融合，包括乳腺癌、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌等17种癌症类型，同时对成人和儿童都是可以使用的；
②
总缓解率高，在TRK融合癌患者的三项大型临床试验汇总数据显示，拉罗替尼的总缓解率ORR为75％，其中22％的患者完全缓解；
③
快速持久的响应，这款药物的神奇之处在于，起效非常快，并且一旦有效，带来的缓解往往是出乎意料的。数据显示，平均的起效时间仅为1.84个月，73％的患者响应的持续时间超过6个月。
[0003]拉罗替尼的合成线路如式1所示，其合成需要用到三个关键中间体，即化合物Ⅰ、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ。
[0004][0005]式1：拉罗替尼的合成线路
[0006]合成拉罗替尼的中间体中，化合物Ⅰ的制备难度较大也尤为重要，从文献报道看，化合物Ⅰ的合成方法主要有手性诱导法、手性辅助试剂法、手性拆分等方法。
>[0007]在专利CN111057729、CN109593803、CN109593802、CN110283858都使用了亚胺还原酶制备化合物I，其中CN110283858仅能制备出S构型，CN109593803、CN109593802公开了使用亚胺还原酶突变体制备R构型，但是没有公开ee值，CN111057729公开了野生型的亚胺还原酶制备R构型化合物I，虽然转化率＞99％，但载量仅为50g/L，且用酶量超过底物量20％不利于后处理，最终产物的ee值97.6％也未达到99％以上。
[0008]针对现有技术的不足，需要一种新的亚胺还原酶制备高ee值的R构型化合物I。
[
技术实现思路
][0009]本专利技术提供一种亚胺还原酶突变体，催化化合物IX为化合物I，提高了转化率，并取得高的ee值，本专利技术还提供亚胺还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶的共表达酶，降低了制备化合物I的成本。
[0010]为了达到专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0011]亚胺还原酶突变体，与氨基酸序列SEQ ID NO：1相比，存在残基差异包括A92、D112、Q189、Q137、Y220、V248、M253、F295中的一个或多个。
[0012]进一步，残基差异包括A92W、D112V\S、Q189M、Q137R\A、Y220Q、V248N、M253A\S、F295W中的一个或多个。
[0013]进一步，残基差异还包括S227Q、G252C中的一个或多个。
[0014]进一步，残基差异还包括P179C、I222C\N中的一个或多个。
[0015]进一步，氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97或99。
[0016]一种制备(R)
‑2‑
(2，5
‑
二氟苯基)吡咯烷酮的方法，使用本专利技术的亚胺还原酶突变体催化底物IX为化合物I
[0017][0018]进一步，将化合物IX、辅酶、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、亚胺还原酶突变体混合进行反应得到化合物I；
[0019]进一步，所述辅酶为NADP；
[0020]进一步，所述化合物IX与亚胺还原酶突变体的质量比为1～10:1；
[0021]进一步，所述辅酶与亚胺还原酶突变体的质量比为0.01～0.1:1；
[0022]进一步，所述葡萄糖与亚胺还原酶突变体的质量比为2～20:1；
[0023]进一步，所述葡萄糖脱氢酶与亚胺还原酶突变体的质量比为0.1～0.5:1；
[0024]进一步，反应条件为磷酸盐调节pH6～7，反应温度为20～30℃，搅拌速度为250～350。
[0025]一种核酸，编码权利本专利技术的亚胺还原酶突变体。
[0026]一种表达载体，包括本专利技术公开的亚胺还原酶突变体的核酸。
[0027]一种细胞，包括本专利技术公开的亚胺还原酶突变体的核酸或载体。
[0028]一种生产亚胺还原酶突变体的方法，培养包括本专利技术公开的细胞得到所述的亚胺还原酶突变体。
[0029]进一步，本专利技术公开的亚胺还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶共表达。
[0030]进一步，用同时含有亚胺还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶基因的细胞生产共表达酶。
[0031]进一步，共表达酶的制备，通过带有限制性内切酶位点的引物将葡萄糖脱氢酶基
因从pET30a
‑
GDH载体上扩增下来。分别用限制性内切酶BamHI和XhoI对带有权利要求1
‑
5所述的亚胺还原酶突变体基因片段的pET30a
‑
IRED载体和扩增获得的带有RBS位点的葡萄糖脱氢酶基因片段进行双酶切，胶回收酶切片段，并用T4 DNA连接酶连接后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得同时含有亚胺还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组菌。
[0032]进一步，生产方法制备得到的亚胺还原酶突变体或者亚胺还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶的共表达酶。
[0033]使用共表达酶催化底物IX为化合物I
[0034][0035]进一步，将化合物IX、辅酶、葡萄糖、共表达酶混合进行反应得到化合物I；
[0036]进一步，所述辅酶为NADP；
[0037]进一步，所述化合物IX与共表达酶的质量比为10:1；
[0038]进一步，所述辅酶与共表达酶的质量比为1:10；
[0039]进一步，所述葡萄糖与共表达酶的质量比为20:1；
[0040]进一步，反应条件为磷酸盐调节pH6～7，反应温度为20～30℃，搅拌速度为250～350。
[0041]相对于现有技术，本专利技术取得的有益效果：
[0042]1、使用本专利技术亚胺还原酶突变体催化制备化合物I(R)
‑2‑
(2,5
‑
二氟苯基)吡咯烷，转化率为99.9％，ee值为100％，底物载量为150g/L。
[0043]2、本专利技术的亚胺还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶共表达酶，在同一个工程菌中表达，在使用亚胺还原酶制备化合物I实现辅酶循环再生，减少再次制备葡萄糖脱氢酶的步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.亚胺还原酶突变体，其特征在于：与氨基酸序列SEQ ID NO：1相比，存在残基差异包括A92、D112、Q189、Q137、Y220、V248、M253、F295中的一个或多个。2.根据权利要求1所述的亚胺还原酶突变体，其特征在于：所述残基差异包括A92W、D112V\S、Q189M、Q137R\A、Y220Q、V248N、M253A\S、F295W中的一个或多个。3.根据权利要求1或2所述的亚胺还原酶突变体，其特征在于：所述残基差异还包括S227Q、G252C中的一个或多个。4.根据权利要求4所述的亚胺还原酶突变体，其特征在于：所述残基差异还包括P179C、I222C\N中的一个或多个。5.根据权利要求4所述的亚胺还原酶突变体，其特征在于：氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97或99。6.一种制备(R)
‑2‑
(2，5
‑
二氟苯基)吡咯烷酮的方法，其特征在于：如权利要求1至5任意一项所述的亚胺还原酶突变体催化底物IX为化合物I7.根据权利要求6所述的制备(R)
‑2‑
(2，5
‑
二氟苯基)吡咯烷酮的方法，其特征在于：将化合物IX、辅酶、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、亚胺还原酶突变体混合进行反应得到化合物I；进一步，所述辅酶为NADP；进一步，所述化合物IX与亚胺还原酶突变体的质量比为1～10:1；进一步，所述辅酶与亚胺还原酶突变体的质量比为0.01～0.1:1；进一步，所述葡萄糖与亚胺还原酶突变体的质量比为2～20:1；进一步，所述葡萄糖脱氢酶与亚胺还原酶突变体的质量比为0.1～0.5:1；进一步，反应条件为磷酸盐调节pH6～7，反应温度为20～30℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈泽聪，
申请(专利权)人：陈泽聪，
类型：发明
国别省市：