一种内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体及生产方法技术

本发明专利技术公开了一种内消旋

【技术实现步骤摘要】
一种内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体及生产方法


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体，还涉及该突变体的生产方法。

技术介绍

[0002]来源于嗜热共生杆菌(Symbiobacterium thermophilum)的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶(StDAPDH)不仅具有极好的热稳定性，并且无需任何改造就可以高立体选择性地还原胺化短链2
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酮酸如丙酮酸合成对应的D
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氨基酸。D
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氨基酸是许多药物分子和生物活性肽的重要结构单元，这些物质广泛用于治疗微生物感染、高血压和癌症。但DAPDH家族结构与功能之间的关系，尤其是关键氨基酸残基对不同底物的催化机制缺乏深入研究，且StDAPDH对2
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酮酸的低活性大大限制了该酶的应用发展。因此在生产催化过程中，提高该酶对2
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酮酸底物的酶活尤为重要。DAPDH利用游离氨还原胺化2
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酮酸合成D
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氨基酸的催化反应(DAPDH还原胺化2
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酮酸合成D
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氨基酸)如下：
[0003][0004]目前已经有相关文献研究了关于内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体的高效催化，如CN 110499301 B公开了一种催化效率提高的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体；通过对其SEQ ID NO:2的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶进行单点/双位点突变，并在大肠杆菌中成功表达并纯化出突变体酶D94A、W123K D94A/W123K W148K,通过酶活测定，发现所述三种内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体具有相对于野生型较高的催化活性，如突变体酶DAPDH
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D94ADAPDH
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W123KDAPDH
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D94A/W123K催化苯丙酮酸的效率分别提高了3.5、1.5、1.3倍，成功提高了关键酶的酶活；
[0005]但上述专利文献CN 110499301 B所述突变酶提高的是催化苯丙酮酸的效率，而本专利技术旨在提高催化草酰乙酸的效率，且CN 110499301 B对于苯丙酮酸的催化效率分别提高了3.5、1.5、1.3倍，也有待提高；本专利技术突变位点与CN 110499301 B中突变位点也完全不同，并且本专利技术旨在达到一个较高针对草酰乙酸的催化效率。

技术实现思路

[0006]为了达到上述目的，提高内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶(StDAPDH)对酮酸底物的催化活性(其氨基酸序列为SEQ ID NO:1)，本专利技术提供一种内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体，相较于野生型酶，对于催化底物草酰乙酸的反应，突变体SEQ ID NO:3的单位酶活力相比野生型酶SEQ ID NO:1提高了至少10倍；能够高效催化草酰乙酸生成D
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天冬氨酸。
[0007]本专利技术所提供的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶的第121位色氨酸突变为缬氨酸，第154位组氨酸突变为甲硫氨酸，第227位组氨酸突变为异亮氨酸获得。
[0008]上述内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]编码上述内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶的核苷酸序列SEQ ID NO:2所示。
[0010]该内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；编码该内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体的基因，基因序列如SEQ ID NO:4所示。
[0011]该突变体的编码基因可以克隆在合适的载体上，然后将载体转化入大肠杆菌感受态细胞中(以大肠杆菌BL21为宿主)，得到表达内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体SEQ ID NO:3的转化子；所述载体可以是pET
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32a(+)系列质粒。
[0012]本专利技术还提供了表达内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体的细胞。
[0013]本专利技术还提供了一种生产内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体的方法，具体为将基因工程菌接种于LB培养基中，于30
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37℃培养至OD
600
为0.6
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0.8，加入诱导剂IPTG于35
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37℃诱导5.5
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6.3h；所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主，表达SEQ ID NO.3所示的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体。
[0014]并且通过上述基因工程菌的发酵，可以获得内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体。例如，在微生物发酵后，菌体用缓冲液重悬，超声破碎，离心，收集上清洗脱目的蛋白，即得纯化的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体。
[0015]本专利技术提供的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体能够应用在制备D
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天冬氨酸的方法中，具体应用为以草酰乙酸和氯化铵为底物，以内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体为催化剂催化生成D
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天冬氨酸。并且能高效催化草酰乙酸生成D
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天冬氨酸，相较于野生型对草酰乙酸的比酶活提高9.2
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10.9倍。
[0016]本专利技术的有益效果如下：
[0017]1.本专利技术提供的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体(W121L、H154M、H227I)SEQ ID NO:3对草酰乙酸具备了更好的催化活性，比酶活相较于野生型得到了极为显著的提高；该突变体显示出了较好的工业化开发和应用前景；
[0018]2.经催化40分钟后，本专利技术突变体酶的酶活力表现能达到27.03U/mg，而野生型酶酶活力仅仅表现为2.48U/mg，差异显著，突变体酶的酶活力提高了10.9倍。
附图说明
[0019]图1野生型酶和突变体酶(W121L、H154M、H227I)SEQ ID NO:3纯化前后的SDS
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PAGE电泳图。
具体实施方式
[0020]下面结合具体实施例进一步描述本专利技术，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本专利技术的范围。
[0021]主要试剂与耗材：pET
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32a(+)质粒为已知的大肠杆菌表达载体，载体大小为5900bp，T7启动子，载体标签N
‑6×
His，载体抗性氨苄青霉素(Ampicillin)，购自So本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO .3所示。2.编码权利要求1所述内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体的基因。3.含有权利要求2所述基因的载体。4.表达权利要求1所述内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体的细胞。5.如权利要求1所述的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶来源于嗜热共生杆菌，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；编码该内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。6.一种基因工程菌，其特征在于，是以大肠杆菌为宿主，表达SEQ ID NO .3所示的内消旋
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二氨基庚二酸脱氢酶突变体。7.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21为宿主，以pET系列质粒为载体。8.如权利要求1所述的内消...

【专利技术属性】
技术研发人员：高秀珍，张亚宁，马钦元，魏浩，曹永军，张同，杨绍梅，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：