一种突变体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1上发生下列位点的突变：S38R；S38R和G34D；S38R和Y128R；S38R和Q332K；S38R、G34D和Y128R；S38R、Y128R和Q332K；S38R、G34D和Q332K；S38R、G34D、Y128R和Q332K。本发明专利技术提供的精氨酸氧化酶突变体与野生型精氨酸氧化酶相比，突变体热稳定性更好。通过本发明专利技术所提供的构建方法得到的精氨酸氧化酶突变体热稳定性更好，在较高的温度下氧化L

【技术实现步骤摘要】
一种突变体及其构建方法和应用
[0001]本申请是申请日为2020年12月30日、申请号为202011624067.4、专利技术名称为“一种突变体及其构建方法和应用”的中国专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种突变体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0003]L
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氨基酸氧化酶是一类生物体内参与氨基酸氧化代谢的重要氧化还原酶，能够以氧分子为电子受体催化L
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氨基酸氧化脱氨，生成相应的酮酸、氨(NH3)和过氧化氢(H2O2)。有些L
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氨基酸氧化酶能够专一性识别特定氨基酸，而不受其他种类氨基酸的干扰，因而在手性胺类化合物拆分、α
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酮酸生物合成、临床样本、食品及氨基酸发酵过程中氨基酸含量检测等领域都发挥着重要作用。其中，L
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精氨酸氧化酶能够特异性识别L
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精氨酸，是生命活动的重要催化剂，且催化反应条件温和、产物单一、耗能小、产物易分离，在食品、化工、环保、能源以及医药领域都有着广泛地应用。然而，由于天然L
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精氨酸氧化酶在高温、极端的酸碱度、有机溶剂、非天然底物、产物抑制等苛刻条件下的稳定性及催化活性将大大降低，限制了其在工业生产方面的应用。
[0004]蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质以满足人类对生产和生活的需求。理性设计是蛋白质工程改造中最常用的方法，利用计算机辅助分子模型结合定点突变，以实现蛋白质功能优化，如提高催化活性、热稳定性、耐酸碱性等。为了有效优化蛋白质的热稳定性，Markus Wyss等人于2001年提出Consensus Concept理论。和常规蛋白质理性设计方法基于蛋白质精确结构
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功能关系不同的是，Consensus Concept理论是基于同源蛋白的氨基酸序列信息，从进化的角度分析能提高酶热稳定性的信息。本专利技术以Consensus Concept理论为指导思想，对L
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氨基酸氧化酶家族序列进行整合分析，并结合生物信息学辅助，获得具高稳定性的新型L
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精氨酸氧化酶ARod突变体。相关研究目前未见报道。

技术实现思路

[0005]因此，本专利技术的目的是针对现有的精氨酸氧化酶突变体的热稳定性不足的问题，提供一种具有热稳定性的突变体、所述突变体的基因序列以及包含该突变体的可溶性蛋白、固定化酶、重组工程细胞、重组载体，用于催化氧化L
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精氨酸。
[0006]根据本申请公开的第一方面，提供了一种突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1上发生下列位点的突变：
[0007]S38R；
[0008]S38R和G34D；
[0009]S38R和Y128R；
[0010]S38R和Q332 K；
[0011]S38R、G34D和Y128R；
[0012]S38R、Y128R和Q332K；
[0013]S38R、G34D和Q332K；
[0014]S38R、G34D、Y128R和Q332K。
[0015]在一些可能的实现方式中，所述突变体对应的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16。
[0016]根据本申请公开的第二方面，所述基因序列被配置为SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31中的任一种，其中：
[0017]编码突变位点为S38R的突变体的核酸序列为SEQ ID NO.18；
[0018]编码突变位点为G34D和S38R的突变体的核酸序列为SEQ ID NO.21；
[0019]编码突变位点为S38R和Y128R的突变体的核酸序列为SEQ ID NO.24；
[0020]编码突变位点为S38R和Q332K的突变体的核酸序列为SEQ ID NO.25；
[0021]编码突变位点为G34D、S38R和Y128R的突变体的精氨酸氧化酶突变体的核酸序列为SEQ ID NO.27；
[0022]编码突变位点为G34D、S38R和Q332K的突变体的精氨酸氧化酶突变体的核酸序列为SEQ ID NO.28；
[0023]编码突变位点为S38R、Y128R和Q332K的突变体的核酸序列为SEQ ID NO.29；
[0024]编码突变位点为G34D、S38R、Y128R和Q332K的突变体的核酸序列为SEQ ID NO.31。
[0025]进一步地，所述突变位点G34D的扩增引物对的核酸序列为SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33。
[0026]进一步地，所述突变位点S38R的扩增引物对的核酸序列为SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35。
[0027]进一步地，所述突变位点Y128R的扩增引物对的核酸序列为SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37。
[0028]进一步地，所述突变位点Q332K的扩增引物对的核酸序列为SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39。
[0029]根据本申请公开的第三方面，提供了一种可溶性蛋白，其被配置为包括如前述突变体。
[0030]根据本申请公开的第四方面，提供了一种固定化酶，其被配置为包括如前述突变体。
[0031]根据本申请公开的第五方面，提供了一种重组工程细胞，其被配置为包括如前述突变体的编码序列。
[0032]根据本申请公开的第六方面，提供了一种重组载体，其被配置为包括如前述突变体的编码序列。
[0033]根据本申请公开的第七方面，提供了前述突变体、可溶性蛋白、固定化酶、重组工程细胞或重组载体在催化氧化L
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精氨酸中的应用。
[0034]本申请公开提供的突变体包括单点突变体和组合突变体，与野生型精氨酸氧化酶相比，其单点突变体和组合突变体在42℃下半衰期均更长；尤其是组合突变体，表现出单点突变体热稳定性的叠加效果，其半衰期大约是野生型精氨酸氧化酶的6倍。因此，本申请公开所提供的突变体的热稳定性更好，适于在较高的温度下催化氧化L
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精氨酸。
[0035]本申请公开提供的突变体的构建方法，与理性设计基于蛋白质精确结构
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功能关系不同的是，本专利技术以Consensus Concept理论为指导思想，从进化的角度分析能提高酶热稳定性的信息，对氨基酸氧化酶家族序列进行整合分析，并结合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1上发生下列位点的突变：S38R；S38R和G34D；S38R和Y128R；S38R和Q332 K；S38R、G34D和Y128R；S38R、Y128R和Q332K；S38R、G34D和Q332K；S38R、G34D、Y128R和Q332K。2.根据权利要求1所述突变体，其特征在于，所述突变体对应的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16。3.一种编码权利要求2所述突变体的基因序列，其特征在于，所述基因序列被配置为SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31中的任一种，其中：编码突变位点为S38R的突变体的核酸序列为SEQ ID NO.18；编码突变位点为G34D和S38R的突变体的核酸序列为SEQ ID NO.21；编码突变位点为S38R和Y128R的突变体的核酸序列为SEQ ID NO.24；编码突变位点为S38R和Q332K的突变体的核酸序列为SEQ ID NO.25；编码突变位点为G34D、S38R和Y128R的突变体的精氨酸氧化酶突变体的核酸序列为SEQ ID NO.27；编码突变位点为G34D、S38R和Q332K的突变体的精氨酸氧化酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：马富强，陆泽林，江晶洁，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：