亮氨酸脱氢酶突变体及其在非天然α-氨基酸合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了亮氨酸脱氢酶突变体及其在非天然α

【技术实现步骤摘要】
亮氨酸脱氢酶突变体及其在非天然
α
‑
氨基酸合成中的应用


[0001]本专利技术涉及亮氨酸脱氢酶突变体及其在非天然α
‑
氨基酸合成中的应用，属于酶工程和微生物工程


技术介绍

[0002]手性非天然α
‑
氨基酸作为结构砌块和合成前体被广泛应用于多肽、药物活性成分及生物活性分子等合成。例如，L
‑2‑
氨基丁酸可用作合成抗惊厥药物Levetiracetam(左乙拉西坦)和抗结核药物Ethambutol(乙胺丁醇)的前体；L
‑
叔亮氨酸可用作合成抗逆转录病毒药物Atazanavir(阿他那韦)的前体；L
‑
苯甘氨酸可用合成治疗库欣综合征的多肽Pasireotide(帕西肽)；L
‑
高苯丙氨酸是当下世界上大约20种治疗高血压药物，包括Benazepril(贝那普利)、Captopril(卡托普利)、Delapril(地拉普利)、Imidapril(咪达普利)的共同中间体。此外，非天然α
‑
氨基酸可以很容易地转化为其他有价值的化合物，例如手性β
‑
氨基醇分子家族。因此，作为结构砌块和合成前体的非天然α
‑
氨基酸的绿色、高效合成具有极大的实际应用价值。
[0003]α
‑
氨基酸脱氢酶家族能够催化α
‑
酮酸底物直接不对称地还原胺化反应。在偶联辅酶循环系统时，α
‑
氨基酸脱氢酶只需消耗廉价的还原剂即可一步催化α
‑
酮酸生成α
‑
氨基酸，其副产物仅为水，十分绿色，且其产物的光学纯度(ee值)可达99％，因此，α
‑
氨基酸脱氢酶催化α
‑
酮酸的不对成还原胺化反应是最具潜力的生产手性非天然α
‑
氨基酸作的方法(图1)。
[0004]α
‑
氨基酸脱氢酶家族中，谷氨酸脱氢酶(GluDH)具有严格的底物特异性，仅能催化侧链含有羧基的α
‑
酮戊二酸底物生成相应的L
‑
谷氨酸，在非天然α
‑
氨基酸合成中应用极少；苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)可催化侧链带有苯环的α
‑
苯丙酮酸及其衍生物制备相应的L
‑
苯丙氨酸及其同系物，但其底物特异性同样受限于一定的范围。
[0005]亮氨酸脱氢酶(LeuDH，EC 1.4.1.9)可催化一系列脂肪族和芳香族α
‑
酮酸直接不对称合成手性α
‑
氨基酸，其底物范围较谷氨酸脱氢酶和苯丙氨酸脱氢酶更广泛，是一种潜在的非天然α
‑
氨基酸的工业合成用酶。然而，野生型亮氨酸脱氢酶仅能够高效地催化其天然底物4
‑
甲基
‑2‑
氧代戊酸合成L
‑
亮氨酸，对一系列具有工业应用价值的非天然α
‑
氨基酸产物的合成效率大大降低。
[0006]因此，急需获得对系列具有工业应用价值的手性非天然α
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氨基酸的合成效率更高的亮氨酸脱氢酶突变体以解决现有非天然α
‑
氨基酸合成中存在的缺陷。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题是提供一种(数种)对系列具有工业应用价值的非天然α
‑
氨基酸的合成效率高的亮氨酸脱氢酶突变体。
[0008]本专利技术提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第143的苏氨酸突变为甘氨酸，命名为突变体T143G；
[0009]或，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第143的苏氨酸突变为甘氨酸，第49位的亮氨酸突变为甘氨酸。命名为突变体T143G/L49G；
[0010]或，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第143的苏氨酸突变为亮氨酸，命名为突变体T143L；
[0011]或，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第143的苏氨酸突变为亮氨酸，第303位的缬氨酸突变为亮氨酸，命名为突变体T143L/V303L。
[0012]本专利技术还提供了编码上述亮氨酸脱氢酶突变体的基因。
[0013]本专利技术还提供了携带上述基因的载体。
[0014]本专利技术还提供了携带上述基因或上述载体的重组细胞。
[0015]在一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为宿主细胞。
[0016]本专利技术还提供了一种重组大肠杆菌，表达上述亮氨酸脱氢酶突变体。
[0017]在一种实施方式中，以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET28(+)为表达载体。
[0018]本专利技术还提供了一种催化合成L
‑
苯甘氨酸的方法，所述方法为以苯乙醛酸为底物，利用上述突变体T143G或突变体T143G/L49G与葡萄糖脱氢酶偶联反应合成L
‑
苯甘氨酸；
[0019]或，所述方法为以苯乙醛酸为底物，利用表达突变体T143G或突变体T143G/L49G的重组细胞与表达葡萄糖脱氢酶的重组细胞偶联反应合成L
‑
苯甘氨酸。
[0020]本专利技术还提供了一种催化合成L
‑2‑
氨基丁酸的方法，所述方法为以2
‑
氧代
‑
丁酸为底物，利用上述突变体T143L或突变体T143L/V303L与葡萄糖脱氢酶偶联反应合成L
‑2‑
氨基丁酸；
[0021]或，所述方法为以2
‑
氧代
‑
丁酸为底物，利用表达上述突变体T143L或突变体T143L/V303L的重组细胞与表达葡萄糖脱氢酶的重组细胞偶联反应合成L
‑2‑
氨基丁酸。
[0022]本专利技术还提供了上述亮氨酸脱氢酶突变体，或上述基因，或上述载体，或上述重组细胞，或上述重组大肠杆菌在制备非天然α
‑
氨基酸中的应用。
[0023]在一种实施方式中，所述非天然α
‑
氨基酸包括L
‑2‑
氨基丁酸或L
‑
苯甘氨酸。
[0024]本专利技术还提供了上述亮氨酸脱氢酶突变体，或上述基因，或上述载体，或上述重组细胞，或上述重组大肠杆菌在医药领域中的应用。
[0025]有益效果：
[0026](1)以苯乙醛酸为底物进行动力学参数测定，野生型亮氨酸脱氢酶的催化效率(k
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)为6.12mM
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‑1，双点突变体T143G/L49G的催化效率(k
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第143的苏氨酸突变为甘氨酸，命名为突变体T143G；或，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第143的苏氨酸突变为甘氨酸，第49位的亮氨酸突变为甘氨酸。命名为突变体T143G/L49G；或，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第143的苏氨酸突变为亮氨酸，命名为突变体T143L；或，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第143的苏氨酸突变为亮氨酸，第303位的缬氨酸突变为亮氨酸，命名为突变体T143L/V303L。2.编码权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体的基因。3.携带权利要求2所述基因的载体。4.携带权利要求2所述基因或权利要求3所述载体的重组细胞。5.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体。6.根据权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET28(+)为表达载体。7.一种催化合成L
‑
苯甘氨酸的方法，其特征在于，所述方法为以苯乙醛酸为底物，利用权利要求1所述突变体T143G或突变体T143G/L49G与葡萄糖脱氢酶偶联反应合成L...

【专利技术属性】
技术研发人员：穆晓清，吴涛，徐岩，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：