用于生产反式-4-羟基脯氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种用于生产反式

【技术实现步骤摘要】
用于生产反式
‑4‑
羟基脯氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及化合物生物技术及发酵工程技术生产领域，尤其是一种用于生产反式
‑4‑
羟基脯氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]反式
‑4‑
羟脯氨酸(trans
‑4‑
Hydroxy
‑
L
‑
proline)，羟脯氨酸由脯氨酸羟基化得到，关键酶为脯氨酸羟化酶，它是动物结构蛋白(如胶原蛋白和弹性蛋白)的天然成分，被广泛应用于医药、食品、饲料及化妆品领域。现如今，随着人们对羟脯氨酸功能研究的逐渐深入，其市场需求还在不断扩大。
[0003]反式
‑4‑
羟脯氨酸的生产方法主要有蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法，但前两种方法使用大量的酸碱试剂及有机试剂，存在提取困难、污染严重、价格昂贵等问题，无法满足生产的需求。
[0004]微生物发酵法是以廉价的葡萄糖为碳源进行微生物生产的高效方法，具有绿色环保、操作简单等优点，但往往发酵过程难以控制。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种大肠杆菌菌株。
[0006]本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述大肠杆菌菌株的构建方法。
[0007]本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述大肠杆菌菌株的应用。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：
[0009]一种用于生产反式
‑4‑
羟基脯氨酸的基因工程菌，命名为E.coli Hyp，所述基因工程菌E.coli Hyp是在野生型大肠杆菌的染色体基因组上敲除脯氨酸脱氢酶基因；染色体基因组上敲除脯氨酸转运蛋白基因；染色体基因组上敲除脯氨酸转运体基因；染色体基因组上敲除DNA结合转录抑制因子基因；染色体基因组上敲除异柠檬酸裂解酶基因；并分别在基因组mbhA位点和yghX位点上整合密码子优化(按照大肠杆菌密码子偏好性进行优化)后的谷氨酸激酶基因proB(NCBI
‑
Gene ID:946425)，并由Ptrc启动子(具有序列表SEQ ID NO.9所示核苷酸序列)启动；在基因组yciQ位点上整合吡咯啉
‑5‑
羧酸还原酶基因proC(NCBI
‑
Gene ID:945034)；并由同一个Ptrc启动子启动；分别在基因组yciT位点和ycgH位点上整合密码子优化后的谷氨酸半醛脱氢酶基因proA(NCBI
‑
Gene ID:946680)，并由Ptrc启动子启动；在基因组ygaY位点上整合密码子优化后的脯氨酸羟化酶基因Hyp，并由Ptrc启动子启动；在基因组yeeP位点上整合密码子优化后的解酮酶基因XfP(NCBI
‑
Gene ID:56674845))并由同一个Ptrc启动子启动；在基因组yjiP位点上分段整合吡啶核苷酸转氢酶基因pntA(NCBI
‑
GeneID:946628)和pntB(NCBI
‑
Gene ID:886830)，并由同一个Ptrc启动子启动；在基因组yjiV位点上整合透明颤菌血红蛋白基因vhB(NCBI
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Gene ID:CP020373.1)，并由同一个Ptrc启动子启动；在基因组yjgX位点上整合脯氨酸转运蛋白基因cgl2622(NCBI
‑
Gene ID:
CP025533.1)，并由同一个Ptrc启动子启动。
[0010]优选的，上述用于生产反式
‑4‑
羟基脯氨酸的基因工程菌，所述野生型大肠杆菌为大肠杆菌E.coli W3110(ATCC 27325)。
[0011]优选的，上述用于生产反式
‑4‑
羟基脯氨酸的基因工程菌，所述脯氨酸羟化酶基因为密码子优化后基因Hyp。
[0012]上述用于生产反式
‑4‑
羟基脯氨酸的基因工程菌的构建方法，采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli W3110染色体基因组进行定向改造，具体步骤如下：
[0013](1)为了进一步增加脯氨酸的供应，阻断脯氨酸反馈抑制途径，对脯氨酸脱氢酶编码基因putA进行敲除；
[0014](2)为了减弱脯氨酸向胞内积累，阻断脯氨酸向胞内运输，对脯氨酸转运蛋白编码基因proP进行敲除；
[0015](3)为了减弱脯氨酸的内排途径，阻断脯氨酸向胞内运输，对脯氨酸转运体编码基因putP进行敲除；
[0016](4)为了减少对Ptrc启动子的抑制，增强其表达效果，对DNA结合转录抑制因子编码基因lacI进行敲除；
[0017](5)为了减弱α
‑
酮戊二酸分支代谢途径，阻断乙醛酸代谢，对异柠檬酸裂解酶编码基因aceA进行敲除；
[0018](6)为了进一步加强脯氨酸合成途径，将密码子优化后的谷氨酸激酶编码基因proB整合至大肠杆菌基因组的mbhA和yghX位点，并用Ptrc启动子控制转录；
[0019](7)为了进一步加强脯氨酸合成代谢通路，将吡咯啉
‑5‑
羧酸还原酶编码基因proC整合至大肠杆菌基因组的yciQ位点，用同一个Ptrc启动子控制转录；
[0020](8)为了进一步加强脯氨酸合成途径，将密码子优化后的谷氨酸半醛脱氢酶编码基因proA整合至大肠杆菌基因组的yciT和ycgH位点，并用Ptrc启动子控制转录；
[0021](9)为了加强反式
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羟基脯氨酸合成途径，将密码子优化后的脯氨酸羟化酶编码基因Hyp整合至大肠杆菌基因组的yghX位点，用同一个Ptrc启动子控制转录；
[0022](10)为了加强谷氨酸合成途径，将密码子优化后的解酮酶编码基因xfP整合至大肠杆菌基因组的yeeP位点，用同一个Ptrc启动子控制转录；
[0023](11)为了加强细胞内NADPH供应，将吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntA和pntB整合至大肠杆菌基因组的yjiP位点，用同一个Ptrc启动子控制转录；
[0024](12)为了加强细胞内氧的代谢途径，将血红颤菌蛋白编码基因vhB整合至大肠杆菌的yjiV位点，用同一个Ptrc启动子控制转录；
[0025](13)为了加强脯氨酸向细胞外转运，将脯氨酸转运蛋白编码基因cgl2622整合至大肠杆菌的yjgX位点，用同一个Ptrc启动子控制转录。
[0026]上述基因工程菌在生产反式
‑4‑
羟基脯氨酸方面的应用。
[0027]优选的，上述基因工程菌的应用，利用所述基因工程菌进行摇瓶发酵：按总体积10％
‑
15％的接种量接种菌种活化后制备的种子液到装有发酵培养基的三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，220r/min振荡培养，发酵过程中通过补加25％的氨水(V/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生产反式
‑4‑
羟基脯氨酸的基因工程菌，其特征在于：命名为E.coli Hyp，所述基因工程菌E.coli Hyp是在野生型大肠杆菌的染色体基因组上敲除脯氨酸脱氢酶基因；染色体基因组上敲除脯氨酸转运蛋白基因；染色体基因组上敲除脯氨酸转运体基因；染色体基因组上敲除DNA结合转录抑制因子基因；染色体基因组上敲除异柠檬酸裂解酶基因；并分别在基因组mbhA位点和yghX位点上整合密码子优化后的谷氨酸激酶基因proB，并由Ptrc启动子启动；在基因组yciQ位点上整合吡咯啉
‑5‑
羧酸还原酶基因proC；并由同一个Ptrc启动子启动；分别在基因组yciT位点和ycgH位点上整合密码子优化后的谷氨酸半醛脱氢酶基因proA，并由Ptrc启动子启动；在基因组ygaY位点上整合密码子优化后的脯氨酸羟化酶基因Hyp，并由Ptrc启动子启动；在基因组yeeP位点上整合密码子优化后的解酮酶基因XfP并由同一个Ptrc启动子启动；在基因组yjiP位点上分段整合吡啶核苷酸转氢酶基因pntA和pntB，并由同一个Ptrc启动子启动；在基因组yjiV位点上整合透明颤菌血红蛋白基因vhB，并由同一个Ptrc启动子启动；在基因组yjgX位点上整合脯氨酸转运蛋白基因cgl2622，并由同一个Ptrc启动子启动。2.根据权利要求1所述的用于生产反式
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羟基脯氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述野生型大肠杆菌为大肠杆菌E.coliW3110。3.权利要求1所述用于生产反式
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羟基脯氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli W3110染色体基因组进行定向改造，具体步骤如下：(1)为了进一步增加脯氨酸的供应，阻断脯氨酸反馈抑制途径，对脯氨酸脱氢酶编码基因putA进行敲除；(2)为了减弱脯氨酸向胞内积累，阻断脯氨酸向胞内运输，对脯氨酸转运蛋白编码基因proP进行敲除；(3)为了减弱脯氨酸的内排途径，阻断脯氨酸向胞内运输，对脯氨酸转运体编码基因putP进行敲除；(4)为了减少对Ptrc启动子的抑制，增强其表达效果，对DNA结合转录抑制因子编码基因lacI进行敲除；(5)为了减弱α
‑
酮戊二酸分支代谢途径，阻断乙醛酸代谢，对异柠檬酸裂解酶编码基因aceA进行敲除；(6)为了进一步加强脯氨酸合成途径，将密码子优化后的谷氨酸激酶编码基因proB整合至大肠杆菌基因组的mbhA和yghX位点，并用Ptrc启动子控制转录；(7)为了进一步加强脯氨酸合成代谢通路，将吡咯啉
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羧酸还原酶编码基因proC整合至大肠杆菌基因组的yciQ位点，用同一个Ptrc启动子控制转录；(8)为了进一步加强脯氨酸合成途径，将密码子优化后的谷氨酸半醛脱氢酶编码基因proA整合至大肠杆菌基因组的yciT和ycgH位点，并用Ptrc启动子控制转录；(9)为了加强反式
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羟基脯氨酸合成途径，将密码子优化后的脯氨酸羟化酶编码基因Hyp整合至大肠杆菌基因组的yghX位点，用同一个Ptrc启动子控制转录；(10)为了加强谷氨酸合成途径，将密码子优化后的解...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐庆阳，龚雨，孙鹏杰，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：