一种生产L-精氨酸的基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，本发明专利技术提供了一种生产L

【技术实现步骤摘要】
glutamicum ATCC 13032的精氨酸生物合成相关基因簇argC、argJ、argB、argD、argF、argG、argH以及编码精氨酸转运蛋白的基因lysE；并且异源过表达来源于B.subtilis A260的编码氨甲酰磷酸合成酶的基因pyrAA、pyrAB；并且含有氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的大肠杆菌RNA聚合酶β
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亚基RpoB突变体。
[0009]第二方面，本专利技术提供了如上所述的基因工程菌的构建方法，包括：在宿主大肠杆菌中引入Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的精氨酸生物合成相关基因簇argC、argJ、argB、argD、argF、argG、argH以及编码精氨酸转运蛋白的基因lysE并过表达；引入B.subtilis A260的编码氨甲酰磷酸合成酶的基因pyrAA、pyrAB并过表达；并且将以下基因敲除或失活：编码精氨酸脱羧酶的基因speA、编码精氨酸脱羧酶的基因adiA和编码精氨酸琥珀酰转移酶的基因astA；并将大肠杆菌自身RNA聚合酶β
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亚基RpoB的第564位氨基酸由脯氨酸突变为苏氨酸。
[0010]第三方面，本专利技术提供了如上所述的基因工程菌在高效生产L
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精氨酸中的应用。
[0011]第四方面，本专利技术提供了利用如上所述的基因工程菌生产L
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精氨酸的方法，包括：在培养基中培养所述基因工程菌以使其生产L
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精氨酸；以及，从所述基因工程菌和/或所述培养基中收集所述L
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精氨酸。
[0012]第五方面，本专利技术提供一种大肠杆菌RNA聚合酶β
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亚基RpoB突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0013]本专利技术的有益效果如下：
[0014]本专利技术选用生长周期短、代谢途径清晰、分子操作便捷的大肠杆菌为出发菌株，从L
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精氨酸合成代谢途径的基因工程改造和整个代谢网络的工程改造出发，对大肠杆菌中精氨酸合成途径和整个氨基酸代谢网络中与精氨酸相关的代谢流进行分析重构，得到一株遗传背景清晰，不携带质粒，不经诱变且能稳定高效生产L
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精氨酸的基因工程菌株。
[0015]rpoB基因编码RNA聚合酶β
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亚基，与细胞内全局转录调控有关，对维持细胞代谢平衡及碳源分配具有重要作用，但该基因与L
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精氨酸合成途径的关系及作用尚不清晰。本专利技术证实，RpoB P564T突变体可以显著提升大肠杆菌生产L
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精氨酸的生产水平。具体而言，与出发菌株ARG9相比，含有RpoB P564T突变体的基因工程菌株ARG10中L
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精氨酸积累浓度从24.5g/L提升到30.1g/L，L
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精氨酸产率提高了22.9％。
具体实施方式
[0016]下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。
[0017]第一方面，本专利技术提供了一种生产L
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精氨酸的基因工程菌，该基因工程菌以大肠杆菌为宿主，不表达以下基因：编码精氨酸脱羧酶的基因speA、编码精氨酸脱羧酶的基因adiA和编码精氨酸琥珀酰转移酶的基因astA；并且异源过表达来源于Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的精氨酸生物合成相关基因簇argC、argJ、argB、argD、argF、argG、argH以及编码精氨酸转运蛋白的基因lysE；并且异源过表达来源于B.subtilis A260的编
码氨甲酰磷酸合成酶的基因pyrAA、pyrAB；并且含有氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的大肠杆菌RNA聚合酶β
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亚基RpoB突变体。
[0018]根据本专利技术，用于构建所述基因工程菌的宿主可以是任意的大肠杆菌，例如，本领域常见用作基因工程宿主的E coli MG1655、E coli W3110、E coli BL21、E.coli BW25113等模式菌株，只要可以对其进行基因工程改造表达上述需要过表达或异源过表达的基因即可；上述大肠杆菌各基因的选择根据所选宿主进行选择，但均是实现同一功能的基因。
[0019]根据本专利技术一种优选的实施方式，所述宿主是E.coli MG1655。
[0020]根据本专利技术，不表达上述基因的方式可以采取本领域常规手段，例如，通过本领域常规手段使该基因失活或者将该基因敲除。
[0021]根据本专利技术，所述不表达是指该基因表达产物的量显著低于原有水平，例如，显著降低了至少50％、60％、70％、80％、90％、100％。
[0022]根据本专利技术，所述过表达是指该基因表达产物的量显著高于原有水平，例如，提高了150％或更多，200％或更多，300％或更多。
[0023]根据本专利技术，过表达上述基因的方式，可以通过在大肠杆菌基因组中引入和/或增加该基因的拷贝数(例如，通过pET28a、pTrc99a、pSTV28等自主复制质粒增加基因的拷贝数，或者增加大肠杆菌染色体中该基因的拷贝数)，或者修饰该基因的表达调控序列(例如，启动子，核糖体结合位点等)，或者以上方法的组合。
[0024]根据本专利技术一种优选的实施方式，过表达上述基因的方式是将该基因连接了强启动子并整合在大肠杆菌基因组中，其中基因的整合位点可以根据本领域技术人员常规认知选择一些不会对细菌生长和基础代谢产生明显影响的假基因位点，例如yeeP、ygiP、yghX、ygaY、yjiT、yjiP、ycjV、ycgH、ygaY、yeeL、ilvG、rph等基因位点都是可以选择的；所述强启动子可以选择P
trc
、BBa
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J23100、T7中任意一种，优选P
trc
。
[0025]第二方面，本专利技术提供了如上所述的基因工程菌的构建方法，包括：在宿主大肠杆菌中引入Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的精氨酸生物合成相关基因簇argC、argJ、argB、argD、argF、argG、argH以及编码精氨酸转运蛋白的基因lysE并过表达；引入B.subtilis A260的编码氨甲酰磷酸合成酶的基因pyrAA、pyrAB并过表达；并且将以下基因敲除或失活：编码精氨酸脱羧酶的基因speA、编码精氨酸脱羧酶的基因adiA和编码精氨酸琥珀酰转移酶的基因astA；并将大肠杆菌自身RNA聚合酶β
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亚基RpoB的第564位氨基酸由脯氨酸突变为苏氨酸。
[0026]本专利技术第一方面已经本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产L
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精氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，不表达以下基因：编码精氨酸脱羧酶的基因speA、编码精氨酸脱羧酶的基因adiA和编码精氨酸琥珀酰转移酶的基因astA；并且异源过表达来源于Corynebacterium glutamicum ATCC13032的精氨酸生物合成相关基因簇argC、argJ、argB、argD、argF、argG、argH以及编码精氨酸转运蛋白的基因lysE；并且异源过表达来源于B.subtilis A260的编码氨甲酰磷酸合成酶的基因pyrAA、pyrAB；并且含有氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的大肠杆菌RNA聚合酶β
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亚基RpoB突变体。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述精氨酸生物合成相关基因簇argC、argJ、argB、argD、argF、argG、argH连接有启动子P
trc
；和/或所述编码精氨酸转运蛋白的基因lysE连接有启动子P
trc
；和/或所述编码氨甲酰磷酸合成酶的基因pyrAA、pyrAB连接有启动子P
trc
。3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述宿主是E coli MG1655、E coli W3110、E coli BL21或E.coli BW25113其中一种。4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于：所述宿主是E coli MG1655。5.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢希贤，蒋帅，吴鹤云，王瑞瑞，王德虎，马倩，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：