一种生产软骨素的工程益生菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种生产软骨素的工程益生菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。该工程益生菌是以益生菌大肠杆菌Nissle 1917(E.coli Nissle 1917，EcN)为出发菌株，将软骨素合成酶基因(KfoC)和UDP

【技术实现步骤摘要】
一种生产软骨素的工程益生菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种生产软骨素的工程益生菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]硫酸软骨素是一类酸性糖胺聚糖类大分子粘多糖，多以蛋白聚糖侧链的形式广泛存在于动物结缔组织中，特别是软骨、皮肤、血管、韧带和肌腱中。其结构如图1所示，β
‑
1,3糖苷键交替连接葡糖醛酸(GlcA)和N
‑
乙酰半乳糖胺(GalNAc)以形成重复二糖单元，二糖单元间通过β
‑
1,4糖苷键连接组成硫酸软骨素及软骨素的碳链骨架，一般二糖单元有20～100个。硫酸软骨素是经软骨素硫酸化后得到的，软骨素按其硫酸化位置可划分为多种类型。硫酸软骨素A(CS A)、硫酸软骨素C(CS C)分别在C
‑
4位、C
‑
6位羟基上进行硫酸化；硫酸软骨素E在GalNAc的C
‑
4位和C
‑
6位的羟基都会硫酸化；硫酸软骨素B(CS B)的结构是硫酸软骨素A中GlcA的C
‑
5异构化为L
‑
艾杜糖醛酸(IdoA)。其中，动物来源的硫酸软骨素多为CS A和CS C。
[0003]硫酸软骨素在治疗风湿病、骨质疏松症、关节炎、腰间盘突出等方面具有重要作用。在欧美、日本等国家，硫酸软骨素被广泛用于防治心脑血管疾病、动脉粥样硬化、骨关节炎等。硫酸软骨素常与氨基葡萄糖配合使用，可以刺激软骨细胞的增殖以及PGs、Ⅱ型胶原、透明质酸的生物合成，从而缓解骨关节炎患者疼痛、减少关节肿胀和积液，对改善关节功能、治疗骨关节炎具有较好的疗效。硫酸软骨素还有其他多种药理活性，如抗病毒感染、保护黏膜、促进细胞代谢、加速伤口愈合等。硫酸软骨素除了具有多种药理活性，还可以作为保健品、食品中的添加剂，在食品加工、化妆品、临床医学等领域具有广泛的应用开发前景。
[0004]商业化硫酸软骨素主要以鲨鱼软骨、气管、鼻中隔等为来源，采用碱法、酶法等提取方法进行工业化生产。提取、除蛋白、酶解、沉淀干燥等是浓碱法提取硫酸软骨素的主要步骤，而酶法提取则经过酶解、活性炭吸附、醇沉、除杂等流程。目前我国在硫酸软骨素的生产中仍面临结构不均匀、原材料不稳定、容易受到动物源致病微生物及硫酸角质素污染等问题，已经难以满足现代规模化高质量生产硫酸软骨素的需求。此外，现在大多数研究都是利用大肠杆菌K4(E.coli K4)发酵制备软骨素，由于软骨素结构类似物在大肠杆菌K4(E.coli K4)的细胞表面以荚膜多糖的形式存在，因此可以通过发酵培养获得软骨素结构类似物，然后通过对发酵所得软骨素进行硫酸化修饰，进而制备硫酸软骨素。大肠杆菌K4(E.coli K4)荚膜多糖属于Group 2类，其荚膜多糖合成基因簇包括Region 1、Region 2、Region 3这3个主要功能区，3个功能区共同完成多糖链合成及运输。Region 2包含7个基因(kfoABCDEFG)，直接参与血清型特异性多糖的合成，并编码负责UDP糖前体生物合成最后步骤的酶，以及聚合物的组装和果糖基化。kfoA基因编码UDP
‑
葡萄糖差向异构酶，能够将UDP
‑
GlcNAc异构为UDP
‑
Gal Nac；kfoC基因编码软骨素合成酶，通过与前体UDP
‑
葡萄糖醛酸和UDP
‑
N
‑
乙酰半乳糖胺结合并运送至多糖链的非还原末端，重复此过程使多糖链不断延伸，形成软骨素碳链骨架。但是，大肠杆菌K4(E.coli K4)中分离出的K4荚膜多糖，其软骨素碳
链骨架的葡萄糖醛酸残基C
‑
3位连有一个果糖分支，如果以K4荚膜多糖为软骨素碳链骨架合成硫酸软骨素，需去除果糖分支，会导致碳链骨架结构完整性受到破坏，并使软骨素产量严重下降。而且，大肠杆菌K4是致病菌，分泌的毒性因子容易造成产品污染，而去除这些毒性因子将极大增加纯化成本。
[0005]因此，建立一种行之有效、安全的方法来生产非动物组织来源的、结构单一稳定的软骨素(可随后被硫酸化以产生硫酸软骨素)是十分有必要的。

技术实现思路

[0006]1.要解决的问题
[0007]本专利技术针对现有技术中大肠杆菌K4(E.coli K4)生产软骨素中存在的问题，提供了一种生产软骨素的工程益生菌及其构建方法和应用，该工程益生菌以益生菌大肠杆菌Nissle 1917(E.coli Nissle 1917，EcN)为出发菌株，将软骨素合成酶基因(KfoC)和UDP
‑
葡萄糖胺异构酶基因(KfoA)转入至E.coli Nissle 1917，并敲除E.coli Nissle 1917的KfiA基因和KfiC基因而获得的，该工程益生菌实现了软骨素多糖的合成与分泌，可将其用于发酵生产软骨素，本专利技术进一步采用分批补料发酵的方式，使软骨素多糖的产量提高了30倍，为后续软骨素多糖的大规模纯化与硫酸化修饰奠定了基础。
[0008]2.技术方案
[0009]为了解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0010]本专利技术提供了一种生产软骨素的工程益生菌，该工程益生菌是将软骨素合成酶基因(KfoC)和UDP
‑
葡萄糖胺异构酶基因(KfoA)转入至E.coli Nissle 1917，并敲除E.coli Nissle 1917的KfiA基因和KfiC基因而获得的，kfiA和kfiC分别编码GlcUA转移酶和GlcNAC转移酶，E.coli Nissle 1917在KfiA和KfiC两基因的共同参与下能够合成其他多糖，不利于软骨素的产生，为了避免干扰，需敲除E.coli Nissle 1917的KfiA基因和KfiC基因。
[0011]优选地，上述软骨素合成酶基因(KfoC)和UDP
‑
葡萄糖胺异构酶基因(KfoA)来自大肠杆菌K4(E.coli K4)。
[0012]优选地，上述软骨素合成酶基因(KfoC)的基因序列如SEQ ID No.1所示。
[0013]优选地，上述UDP
‑
葡萄糖胺异构酶基因(KfoA)如SEQ ID No.2所示。
[0014]优选地，上述KfoA、KfoC的转入和KfiA、KfiC的敲除，是kfoA基因插入kfiA基因片段、kfoC基因插入kfiC基因片段中，通过插入，既将KfoA、KfoC的转入，同时可以将KfiA、KfiC敲除。
[0015]本专利技术还提供了一种上述生产软骨素的工程益生菌的构建方法，该方法以EcN为出发菌株，以kfoA基因插入kfiA基因片段中的方式将kfoA基因转入EcN并敲EcN的KfiA基因，获得KfiA基因被KfoA基因取代的益生菌EcN
‑
A(EcN/ΔKfiA::KfoA)；再以EcN
‑
A为出发菌株，以kfoC基因插入kfiC基因片段中的方式将kfoC基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产软骨素的工程益生菌，其特征在于，所述工程益生菌是将软骨素合成酶基因和UDP
‑
葡萄糖胺异构酶基因转入至E.coli Nissle 1917，并敲除E.coli Nissle 1917的KfiA基因和KfiC基因而获得的。2.根据权利要求1所述的一种生产软骨素的工程益生菌，其特征在于，所述软骨素合成酶基因和UDP
‑
葡萄糖胺异构酶基因来自大肠杆菌K4，所述软骨素合成酶基因KfoC的基因序列如SEQ ID No.1所示，所述UDP
‑
葡萄糖胺异构酶基因kfoA的基因序列如SEQ ID No.2所示。3.根据权利要求2所述的一种生产软骨素的工程益生菌，其特征在于，所述KfoA、KfoC的转入和KfiA、KfiC的敲除，是kfoA基因插入kfiA基因片段、kfoC基因插入kfiC基因片段中。4.权利要求3所述的一种生产软骨素的工程益生菌的构建方法，其特征在于，所述方法以E.coli Nissle 1917为出发菌株，以kfoA基因插入kfiA基因片段中的方式将kfoA基因转入E.coli Nissle 1917并敲E.coli Nissle 1917的KfiA基因，获得KfiA基因被KfoA基因取代的益生菌EcN
‑
A；再以EcN
‑
A为出发菌株，以kfoC基因插入kfiC基因片段中的方式将kfoC基因转入EcN
‑
A并敲EcN
‑
A的KfiC基因，获得KfiA基因被KfoA基因取代、KfiC基因被KfoC基因取代的生产软骨素的工程益生菌EcN
‑
AC。5.根据权利要求4所述的一种生产软骨素的工程益生菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1：从EcN基因组上扩增kfiA基因的上、下游同源重组手臂，从E.coli K4基因组上扩增kfoA基因；S2：将S1中的kfiA基因上、下游同源重组手臂与kfoA基因通过融合PCR技术连接，得到完整打靶片段ΔKfiA::KfoA；S3：将ΔKfiA::KfoA克隆入自杀质粒pCVD442Gm，获得打靶质粒pCVD442Gm
‑
ΔKfiA::KfoA；用电转化将pCVD442Gm
‑
ΔKfiA::KfoA转入大肠杆菌E.coliβ2155，获得供体菌E.coliβ2155/pCVD442Gm
‑
ΔKfiA::KfoA；将供体菌与大肠杆菌EcN受体菌进行接合实验，在庆大霉素平板上筛选获得抗性的大肠杆菌克隆EcN/pCVD442Gm
‑
ΔKfiA::KfoA；培养至单克隆形成，通过PCR技术筛选获得KfiA基因被KfoA抗性基因取代的克隆EcN
‑
A；S4：从EcN基因组上扩增kfiC基因的上、下游同源重组手臂，从E.coli K4基因组上扩增kfoC基因；S5：将kfiC基因上、下游同源重组手臂与kfoC基因通过融合PCR技术连接，得到完整打靶片段ΔKfiC::KfoC；S6：将ΔKfiC::KfoC克隆入自杀质粒pCVD442Gm，获得打靶质粒pCVD442Gm
‑
ΔKfiC::KfoC；用电转化将pCVD442Gm
‑
ΔKf...

【专利技术属性】
技术研发人员：周贤轩，魏晓珍，孙蓉，汪振洋，杨桂霞，许文静，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：