一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌及构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌及构建方法与应用，其构建方法为：1)敲除盐单胞菌Halomonas sp.TD01中基因phaB和基因phaC；2)将基因mvaE

【技术实现步骤摘要】
一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌及构建方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体地涉及一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌株及构建方法与应用。

技术介绍

[0002]甲羟戊酸(mevalonic acid，MVA)又名甲瓦龙酸，分子式为C6H
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O4，最初作为乳酸菌的乙酸替代生长因子在酒精发酵废液中被发现，后又在火落菌发酵的日本清酒中被发现。甲羟戊酸呈油状，易溶于水和极性有机溶液，在酸性条件下易内酯化形成甲羟戊酸内酯C6H
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O3(mevalonlactone，MVAL)。甲羟戊酸是甲羟戊酸途径(MVApathway)的重要中间体，参与合成类固醇和萜烯，包括异戊二烯、蒎烯、类胡萝卜素、青蒿素和紫杉醇等。目前甲羟戊酸在生产抗疟疾药物青蒿素、抗癌化合物中间体紫杉醇、橡胶前体异戊二烯以及生物燃料3
‑
甲基
‑3‑
丁烯
‑1‑
醇等领域已经有相关应用报道，具有广阔的应用前景。
[0003]甲羟戊酸普遍存在于大多数真核生物、病毒和高等植物中，其生物合成过程为，以三分子乙酰辅酶A为前体，经三步酶反应，消耗两分子还原力NADPH或NADH合成一分子甲羟戊酸。具体为首先乙酰辅酶A乙酰转移酶将两分子乙酰CoA缩合成乙酰乙酰CoA，进一步在3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶作用下引入第三个乙酰CoA分子缩合生成3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG
‑
CoA)，最后HMG
‑
CoA被3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶还原为甲羟戊酸。甲羟戊酸可进一步生成异戊二烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，用于合成下游的萜类和类固醇化合物。除生物合成法外，甲羟戊酸也可通过化学法合成，但由于生物合成法具有可持续性和绿色环保等优势，近年来利用多种微生物，如大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等，通过代谢工程手段改造合成甲羟戊酸的研究越来越多。
[0004]盐单胞菌TD01(Halomonas sp.TD01)是一株中度嗜盐嗜碱微生物，具有耐高盐(NaCl，50～60g/L)、高碱(pH，9～11)、鲁棒性强、底物利用谱广和耐受高浓度有机酸盐等特点。这些独特的生理特征赋予了盐单胞菌可在开放式、不灭菌条件下连续发酵培养，相比于普通模式微生物，以盐单胞菌为底盘细胞在工业应用上更能节约原料、设备和人工的投资成本，简化发酵工艺，具有更高的经济性和价值性。近年来针对盐单胞菌的相关分子生物学方法和基因操作技术都已建立，有利于通过代谢工程及合成生物学的合理设计进行菌株改造。目前盐单胞菌已成为“下一代工业生物技术”的明星底盘，被广泛地改造用于生产各类高附加值产品，包括聚羟基脂肪酸酯、蛋白质、5
‑
氨基乙酰丙酸、L
‑
苏氨酸、四氢嘧啶、3
‑
羟基丙酸、衣康酸等。
[0005]经检索，目前未见有在基因组上改造盐单胞菌Halomonas sp.TD01用于生产甲羟戊酸的相关报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌的构建方法。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌在发酵生产甲羟戊酸的应用。
[0009]本专利技术的第四个目的是提供第二种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌在发酵生产甲羟戊酸的应用。
[0010]本专利技术的技术方案概述如下：
[0011]一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌的构建方法，包括如下步骤：
[0012]1)敲除盐单胞菌Halomonas sp.TD01中3
‑
羟基丁酰辅酶A脱氢酶编码基因phaB和PHA合成酶编码基因phaC；
[0013]2)将乳杆菌来源的3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶编码基因mvaE
lac
和3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶编码基因mvaS
lac
表达单元靶向整合至步骤1)所得菌株基因组G7位点；得到在G7位点整合有mvaE
lac
和mvaS
lac
表达单元的重组菌株Halomonas sp.
[0014]TDMVA
‑
01；
[0015]3)将粪肠球菌来源的3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶编码基因mvaE
ef
和3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶编码基因mvaS
ef
表达单元靶向整合至步骤2)所得菌株基因组G4位点，得到生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌；
[0016]所述基因phaB的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
[0017]所述基因phaC的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0018]所述基因mvaE
lac
和mvaS
lac
表达单元的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0019]所述基因组G7位点的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0020]所述基因mvaE
ef
和mvaS
ef
表达单元的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
[0021]所述基因组G4位点的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
[0022]上述方法构建的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌。
[0023]上述生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌在发酵生产甲羟戊酸中的应用。
[0024]第一种应用，包括如下步骤：
[0025](1)活化菌株：将上述生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌在60LB固体培养基中划线，35
‑
37℃培养8
‑
16h，得到活化菌株；
[0026](2)种子液的制备：将步骤(1)获得的活化菌株接种到60LB液体培养基中，35
‑
37℃，180
‑
240rpm培养8
‑
16h，将所得菌液按照体积比为1％
‑
2％的接种量接种到新制备的60LB液体培养基中，35
‑
37℃，180
‑
240rpm培养8
‑
20h，获得种子液；
[0027](3)摇瓶发酵：将步骤(2)获得的种子液按照体积比为1％
‑
5％的比例接种到装有20
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：1)敲除盐单胞菌Halomonas sp.TD01中3
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羟基丁酰辅酶A脱氢酶编码基因phaB和PHA合成酶编码基因phaC；2)将乳杆菌来源的3
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羟基
‑3‑
甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶编码基因mvaE
lac
和3
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羟基
‑3‑
甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶编码基因mvaS
lac
表达单元靶向整合至步骤1)所得菌株基因组G7位点；得到在G7位点整合有mvaE
lac
和mvaS
lac
表达单元的重组菌株Halomonas sp.TDMVA
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01；3)将粪肠球菌来源的3
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羟基
‑3‑
甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶编码基因mvaE
ef
和3
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羟基
‑3‑
甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶编码基因mvaS
ef
表达单元靶向整合至步骤2)所得菌株基因组G4位点，得到生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌；所述基因phaB的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述基因phaC的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述基因mvaE
lac
和mvaS
lac
表达单元的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述基因组G7位点的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述基因mvaE
ef
和mvaS
ef
表达单元的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述基因组G4位点的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。2.权利要求1的方法构建的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌。3.权利要求2的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌在发酵生产甲羟戊酸中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于包括如下步骤：(1)活化菌株：将权利要求2的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌在60LB固体培养基中划线，35
‑
37℃培养8
‑
16h，得到活化菌株；(2)种子液的制备：将步骤(1)获得的活化菌株接种到60LB液体培养基中，35
‑
37℃，180
‑
240rpm培养8
‑
16h，将所得菌液按照体积比为1％
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2％的接种量接种到新制备的60LB液体培养基中，35
‑
37℃，180
‑
240rpm培养8
‑
20h，获得种子液；(3)摇瓶发酵：将步骤(2)获得的种子液按照体积比为1％
‑
5％的比例接种到装有20
‑
100mL的发酵培养基的500mL锥形瓶中，32
‑
37℃，180
‑
240rpm培养48
‑
80h，得到含有甲羟戊酸的发酵液。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于包括如下步骤：(1)活化菌株：将权利要求2的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌在60LB固体培养基中划线，35
‑
3...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈涛，张静，元跃，王智文，陈国强，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：