用于使用模板转换反应进行cDNA合成和单细胞转录组概况分析的方法和组合物技术

本申请披露了用于以改善的逆转录、模板转换以及预扩增合成cDNA以增加由个体细胞产生的cDNA文库的收率和平均长度的方法。这些新方法包括将TSO 3'端的单个核苷酸残基换成锁核酸(INA)、使用甲基基团供体、和/或高于常规所用的MgCb浓度。结合这些差异的单细胞转录组分析具有全长覆盖度、改善的灵敏度和准确度，具有较少偏差并且更易进行成本有效的自动化。本发明专利技术还提供了在3'端包含锁核酸的cDNA分子、包含这些cDNA分子的组合物和cDNA文库，以及用于单细胞转录组概况分析的方法。单细胞转录组概况分析的方法。单细胞转录组概况分析的方法。

【技术实现步骤摘要】
用于使用模板转换反应进行cDNA合成和单细胞转录组概况分析的方法和组合物
[0001]本申请是申请日为2014年8月22日，申请号为201480053360.6，专利技术名称为“用于使用模板转换反应进行cDNA合成和单细胞转录组概况分析的方法和组合物”的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2014年8月23日提交的美国临时专利申请序列号61/869,220的优先权，该申请的内容通过引用结合在此。


[0004]本专利技术涉及用于以改善的收率和平均长度合成双链cDNA的方法、以及合成的cDNA分子和由个体细胞产生的cDNA文库。

技术介绍

[0005]单细胞基因表达分析具有表征细胞异质性的前景，但是目前的方法牺牲了覆盖度、灵敏度或通量。存在若干用于由大量RNA构建全长cDNA的方法，包括帽富集过程(cap enrichment procedure)(丸山
·
K.(Maruyama,K.)和菅野
·
S.(Sugano,S.)，基因(Gene)138，171
–
174(1994)；卡宁奇
·
P.(Carninci,P.)和林崎
·
Y.(Hayashizaki,Y.)，酶学方法(Meth.Enzymol.)303，19
–
44(1999)；达什
·
M.(Das,M.)等人，生理基因组学(Physiol.Genomics)6，57
–
80(2001))，但是由单细胞量RNA获得全长覆盖度仍然是具有挑战性的。现有方法使用cDNA的3'端polyA加尾(例如，唐F.(Tang,F.)等人，自然方法(Nat.Methods)6,377
–
382(2009)；笹川
·
Y.(Sasagawa,Y.)等人，基因组生物学(Genome Biol.)14，R31(2013))或模板转换(朱Y.Y.(Zhu,Y.Y.)等人，生物技术(BioTechniques)30，892
–
897(2001)；拉姆斯科尔德
·
D.(D.)等人，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)30，777
–
782(2012))，而其他方法由于早期多重化完全牺牲了全长覆盖度(伊斯兰
·
S.(Islam,S.)等人，基因组研究(Genome Res.)(2011)doi：10.1101/gr.110882.110；哈希姆绍尼T.(Hashimshony T.)等人，细胞报告(Cell Rep.)2，666
–
673(2012))。最近已经表明，与polyA加尾方法相比，依赖模板转换的Smart
‑
Seq在整个转录物上具有更加均匀的读段覆盖度(拉姆斯科尔德
·
D.等人，自然生物技术30，777
–
782(2012))，与模板转换在设计来直接捕获RNA 5'端的应用中的常见使用一致，这些应用包括nanoCAGE(普莱西C.(Plessy,C.)等人，自然方法7,528
–
534(2010))和STRT(伊斯兰S.等人，基因组研究(2011)doi：10.1101/gr.110882.110)。利用模板转换的单细胞应用依赖于逆转录、模板转换反应以及统一聚合酶链式反应(PCR)预扩增的效率来获得足量的代表性cDNA以用于测序。尽管广泛使用这些反应，但是尚未报道由单细胞量改善cDNA文库收率和平均长度的系统性努力。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供用于合成cDNA的改进方法，具体而言，在逆转录中，利用模板转换反应进行单细胞应用的模板转换和预扩增，以增加由个体细胞产生的cDNA文库的收率和平均长
度。结合这些差异的单细胞转录组分析具有改善的灵敏度和准确度，并且偏差较少且更易进行成本有效的自动化。
[0007]确切地讲，为了改善由单细胞进行的全长转录组概况分析，本申请披露了在cDNA文库收率和长度方面对逆转录、模板转换寡核苷酸(TSO)以及PCR预扩增的大量变型的评估、以及这些结果与商用Smart
‑
Seq(以下称为)的比较。在此披露的改进出人意料且显著地增加了从少至1ng的启动总RNA获得的cDNA的收率和长度。
[0008]在一个实施例中，本专利技术提供了一种用于制备与RNA分子互补的DNA的方法，该方法包括在包含锁核酸残基的模板转换寡核苷酸(TSO)的存在下进行逆转录反应。
[0009]在另一个实施例中，本专利技术提供了一种增加cDNA收率的方法，包括在cDNA合成中使用诸如甲基基团供体的添加剂。在一个实施例中，该甲基基团供体是甜菜碱。
[0010]在另一个实施例中，本专利技术提供了一种增加cDNA收率的方法，包括在cDNA的合成中使用增大浓度的金属盐，例如MgCl2。
[0011]在一个优选实施例中，该方法包括在cDNA合成中与增大浓度的MgCl2结合使用甲基基团供体。在一个特别优选的实施例中，该方法包括与增大浓度的MgCl2结合使用甲基基团供体甜菜碱，该方法已显示出对cDNA收率的显著的正面影响。
[0012]在另一个实施例中，本专利技术提供了一种增加预扩增cDNA的平均长度的方法，包括在RNA变性之前而不是在逆转录酶(RT)主混合物中给予dNTP。
[0013]在另一个实施例中，本专利技术提供了一种通过根据在此披露的实施例中任一个所述的方法产生的cDNA文库。
[0014]在另一个实施例中，本专利技术提供了根据在此披露的实施例中任一个产生的cDNA文库用于单细胞转录组概况分析的用途。
[0015]在另一个实施例中，本专利技术提供了一种用于分析多个单细胞中的基因表达的方法，包括根据在此披露的实施例中任一个所述的方法制备cDNA文库的步骤；并且对该cDNA文库进行测序。
[0016]已根据本专利技术证实，在纯化的RNA上进行的这些方法可适用于包括例如哺乳动物细胞的个体后生动物细胞。
[0017]在另一个实施例中，本专利技术提供了一种在其3
’
末端包含LNA的模板转换寡核苷酸(TSO)。
[0018]在另一个实施例中，本专利技术提供了根据在此披露的实施例中任一个所述的TSO用于合成双链cDNA的用途。
[0019]参考以下附图和详细描述将更好地理解本专利技术的这些和其他方面。
附图说明
[0020]图1示出cDNA文库收率和长度的改善。(A)相对于使用rG3 oligo获得的那些，使用不同的模板转换寡核苷酸，由1ng总RNA获得的预扩增cDNA的中值收率。所有oligo序列见于表1中。(B)相对于使用类似的条件(甜菜碱和6mM Mg
2+
)获得的cDNA收率，在具有甜菜碱(黑色)或不具有甜菜碱(灰色)的反应液中由1ng总RNA获得且随着增大的Mg
2+
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于改善与RNA分子互补的DNA的合成收率和/或平均长度的方法，该方法包括以下步骤：使cDNA合成引物退火于所述RNA分子并且合成第一cDNA链以形成RNA
‑
cDNA中间体；并且通过使所述RNA
‑
cDNA中间体与模板转换寡核苷酸(TSO)在适于与该RNA分子互补的该第一DNA链延伸的条件下接触进行逆转录反应，从而使该第一DNA链另外与该TSO互补，其中该TSO的3'最末端核苷酸是锁核酸(LNA)，其中所述LNA选自由以下项组成的组：锁鸟嘌呤、锁腺嘌呤、锁尿嘧啶、锁胸腺嘧啶、锁胞嘧啶、以及锁5
‑
甲基胞嘧啶，其中所述TSO包括AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACrGrG+N，其中3'端的+N表示锁核苷酸残基。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述逆转录反应在甲基基团供体和金属盐的存在下进行。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述甲基基团供体是甜菜碱。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述金属盐是镁盐。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述镁盐具有至少7mM的浓度。6.根据权利要求4所述的方法，其中所述镁盐具有至少8mM的浓度。7.根据权利要求4所述的方法，其中所述镁盐具有至少9mM的浓度。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述锁核酸残基选自由锁腺嘌呤和锁尿嘧啶组成的组。9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述锁核酸残基选自由锁胸腺嘧啶、锁胞嘧啶以及锁5
‑
甲基胞嘧啶组成的组。10.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述甲基基团供体是甜菜碱，并且所述金属盐是浓度为至少9mM的MgC12。11.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，该方法进一步包括使用寡核苷酸引物扩增与所述RNA分子和所述模板转换寡核苷酸互补的所述DNA链。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述模板转换寡核苷酸选自下表中的这些寡核苷酸条目TSO名称序列(5
′‑
>3
′
)1rGrG+GAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACrGrG+G。13.根据权利要求1至7和12中任一项所述的方法，其中该cDNA是在包含锚定的olig...

【专利技术属性】
技术研发人员：里卡德，
申请(专利权)人：路德维格癌症研究院，
类型：发明
国别省市：