一种纯化寡核苷酸的方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种纯化寡核苷酸的方法和试剂盒，该方法包括以下步骤：i)提供包含寡核苷酸的固相载体；ii)将所述的固相载体固定在负压装置上，在负压条件下用一种或多种缓冲液处理所述固相载体；和iii)用一种或多种洗脱液洗脱经步骤ii)处理的固相载体，获得纯化的寡核苷酸。本发明专利技术提供的方法快速便捷、价格低廉、回收率高，适配于高通量处理。适配于高通量处理。适配于高通量处理。

【技术实现步骤摘要】
一种纯化寡核苷酸的方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及纯化寡核苷酸的领域。更准确地说，本专利技术涉及一种快速、简便的纯化寡核苷酸的新方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]近年来，全球基因治疗、基因诊断等基因科技行业持续发展，寡核苷酸在分子诊断和治疗中的应用也不断增加，对寡核苷酸的认识不断提高，推动了寡核苷酸市场的不断增长。寡核苷酸一般是指由多个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段。寡核苷酸可由合成仪器自动合成，它可应用于基因治疗、研究和诊断领域，即作为DNA合成的引物(Primer)、基因治疗的药物(Oligo)、基因诊断的探针(Probe)等，在现代分子生物学研究中具有广泛的用途。研究应用领域主要包括PCR、测序和其他研究应用。2020年，PCR引物在全球寡核苷酸市场中占据了最大份额。PCR技术(例如qPCR)利用序列特异性引物，高度敏感且具有成本效益，促进了寡核苷酸(用作探针和引物)的市场需求。经自动化仪器合成出来的寡核苷酸产物，一般需经过氨解、除盐的后处理步骤，除去寡核苷酸上保护基团及残留化学盐分，才能用于下一步PCR应用。
[0003]传统的寡核苷酸脱盐纯化方法包括OPC(Cartridge柱树脂法)、C18(碳18)法、MOP(MOP高分子)法等，原理均是基于寡核苷酸对OPC树脂、C18、MOP等高分子的亲和力吸附，通过去离子水或离子对缓冲液的清洗，乙腈水的洗脱来达到脱盐纯化的目的。通过以上方法虽然可以得到较好的寡核苷酸产物，但整个处理过程较为复杂、费时，存在一定程度(10％
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50％)的损失率，且在进行高通量(192
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384条)的脱盐处理时，成本较为昂贵，导致均未能在市场上大规模推广使用。因此有必要建立一种快速、简便、低损失、低成本的脱盐方法，对推动PCR技术的研究发展具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术涉及一种快速、简便的纯化寡核苷酸的新方法。本专利技术提供的方法快速便捷、价格低廉、回收率高，适配于高通量处理。
[0005]因此，在一方面，本申请提供了一种纯化寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：
[0006]i)提供包含寡核苷酸的固相载体；
[0007]ii)将所述的固相载体固定在负压装置上，在负压条件下用一种或多种缓冲液处理所述固相载体；和
[0008]iii)用一种或多种洗脱液洗脱经步骤ii)处理的固相载体，获得纯化的寡核苷酸。
[0009]在某些实施方案中，在步骤i)之前，所述方法还包括寡核苷酸氨解的步骤。在某些实施方案中，步骤ii)中所述负压条件为2
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5psi。在某些实施方案中，在步骤ii)之后步骤iii)之前，所述方法还包括抽干的步骤。易于理解，在本专利技术的实施方案中，专利技术人利用寡核苷酸在气相氨解后依然滞留在载体内的时间，将氨解后的固相载体固定在负压装置上，用不同的缓冲液进行多次负压洗脱，除去盐分，抽干，最终用洗脱液将脱盐处理好的寡核苷
酸从固相载体上洗脱下来，即可获得纯化的寡核苷酸。
[0010]在某些实施方案中，所述缓冲液含有如下组分：乙腈或腈；和/或所述洗脱液含有如下组分：Tris
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HCl。所述缓冲液可以选自缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D或其组合，其中，缓冲液A为无水乙腈、缓冲液B为90
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95％乙腈、缓冲液C为85
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90％乙腈、缓冲液D为80
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85％腈。
[0011]在某些实施方案中，所述缓冲液A的含水量根据卡尔费休水分仪测得，优选为10
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30ppm。
[0012]在某些实施方案中，所述缓冲液由缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C组成，所述缓冲液也可以由缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D组成。所述缓冲液的组合并不受特别的限制，可以由缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D的任意一种或多种组成，或者也可以包含其他含有乙腈或腈的水溶液。
[0013]在某些实施方案中，所述缓冲液的浓度为1
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100nmol；较佳地，所述缓冲液的浓度为5
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50nmol；更佳地，所述缓冲液的浓度为20
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50nmol。
[0014]在某些实施方案中，所述洗脱液的浓度为10
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30mM，所述洗脱液的pH值为7.5
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8.0。
[0015]在某些实施方案中，所述的寡核苷酸由仪器自动合成，例如DNA合成仪。
[0016]在某些实施方案中，所述的固相载体为合成柱或合成板。在某些实施方案中，所述合成柱为Frit 96合成板，所述合成板为96/384合成板。在某些实施方案中，所述固相载体的浓度为2
‑
50nmol。
[0017]在某些实施方案中，步骤ii)中所述处理固相载体可操作一次或多次，例如操作1、2、3、4、5、6、7次或更多次。在某些实施方案中，每一次重复加入缓冲液的体积为100
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200μL。
[0018]如本领域技术人员容易理解的，当缓冲液为一种时，则步骤ii)中处理所述固相载体则操作1次，例如当缓冲液为缓冲液A时，则步骤ii)中用缓冲液A处理所述固相载体则认为是操作1次，但每一次操作重复至少1、2、3、4、5次或更多次，更具体地，步骤ii)中用200μL缓冲液A处理所述固体载体，由于处于负压的条件下，缓冲液A的液面在固相载体中会下降，再次加入200μL缓冲液A，待液面下降后再次加入200μL缓冲液A，可以理解为一次操作重复3次。当缓冲液为两种时，则步骤ii)中处理所述固相载体则操作两次，例如当缓冲液为缓冲液A和缓冲液B时，步骤ii)中用缓冲液A处理所述固相载体认为是操作1次，每一次操作重复至少1、2、3、4、5次或更多次，用缓冲液B处理所述固相载体则认为是操作第2次，每一次操作重复至少1、2、3、4、5次或更多次，更具体地，步骤ii)用200μL缓冲液A处理所述固相载体，当液面下降后再次加入200μL缓冲液A，待液面再次下降后再次加入200μL缓冲液A，重复3次后，加入200μL缓冲液B，待液面下降后再次加入200μL缓冲液B，同样重复3次，则可以理解为两次操作重复3次，以此类推。如本领域技术人员容易理解的，本专利技术的方法中对缓冲液的种类和加入的体积没有特别限制，理论上可以是一种、两种、三种、四种或更多种，每一种缓冲液处理所述固相载体可以理解为操作一次，故操作次数也是根据缓冲液的种类不同，每一次的操作的重复次数也没有任何限制，可以重复1、2、3、4、5次或更多次，每一次重复加入缓冲液的体积可以是100μL、200μL或任意合适的体积。
[0019]在某些实施方案中，步骤iii)中所述洗脱可操作一次或多次，例如操作1、2、3次或更多次。在某些实施方案中，每一次重复加入洗脱液的体积为100
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200μL。
[0020]如本领域技术人员容易理解的，当洗脱液为一种时，则步骤iii)中所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纯化寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：i)提供包含寡核苷酸的固相载体；ii)将所述的固相载体固定在负压装置上，在负压条件下用一种或多种缓冲液处理所述固相载体；和iii)用一种或多种洗脱液洗脱经步骤ii)处理的固相载体，获得纯化的寡核苷酸。2.权利要求1的方法，具备以下特征中的一项或多项：(1)在步骤i)之前，所述方法还包括寡核苷酸氨解的步骤；(2)在步骤ii)中，所述负压条件为2
‑
5psi；(3)在步骤ii)之后步骤iii)之前，所述方法还包括抽干的步骤。3.权利要求1或2的方法，所述缓冲液含有如下组分：乙腈或腈；和/或所述洗脱液含有如下组分：Tris
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HCl；优选地，所述缓冲液选自：缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D或其组合，其中，缓冲液A为无水乙腈、缓冲液B为90
‑
95％乙腈、缓冲液C为85
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90％乙腈、缓冲液D为80
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85％腈；优选地，所述缓冲液A的含水量根据卡尔费休水分仪测得；优选地，所述缓冲液A的含水量为10
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30ppm；优选地，所述缓冲液由缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C组成；优选地，所述缓冲液由缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D组成；优选地，所述缓冲液的浓度为1
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100nmol；更优选地，所述缓冲液的浓度为5
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50nmol；更优选地，所述缓冲液的浓度为20
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50nmol；优选地，所述洗脱液的浓度为10
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30mM；优选地，所述洗脱液的pH值为7.5
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8.0。4.权利要求1
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3任一项的方法，所述的寡核苷酸由仪器自动合成。5.权利要求1
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4任一项的方法，所述的固相载体为合成柱或合成板；优选地，所述合成柱为Frit 96合成板；优选地，所述合成板为96/384合成板；优选地，所述固相载体的浓度为2
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50nmol。6.权利要求1
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5任一项的方法，步骤ii)中所述处理固相载体可操作一次或多次，例如操作1、2、3、4、5、6、7次或更多次；优选地，每一次操作重复至少1、2、3、4、5次或更多次；优选地，每一次重复加入缓冲液的体积为100
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200μL；优选地，步骤iii)中所述洗脱可操作一次或多次，例如操作1、2、3次或更多次；优选地，每一次操作重复至少1、2、3、4、5次或更多次；优选地，每一次重复加入洗脱液的体积为100
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200μL。7.权利要求1
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6任一项的方法，所述的纯化的寡核苷酸的纯度是至少约90％；优选地，所述的纯化的寡核苷酸的纯度是至少约95％。8.试剂盒，其包括缓冲液和洗脱液；缓冲液含有如下组分：乙腈或腈；洗脱液含有如下组分：Tris
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HCl；优选地，所述缓冲液选自：缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D或其组合，其中，缓冲液
A为无水乙腈、缓冲液B为90
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95％乙腈、缓冲液C为85
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90％乙腈、缓冲液D为80
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85％腈；优...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖晔，李璐璐，薛煌淇，
申请(专利权)人：杭州联川生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：