鉴定小分子靶标的高通量筛选方法技术

本文提供了用于鉴定蛋白质结合配偶体对的方法，该蛋白质结合配偶体对的突变可以为药学上有用的小分子的发现提供信息。本文公开的方法可以容许调整天然蛋白质降解系统以在蛋白质水平上调控特定疾病的靶标，具体地，针对那些长期被认为无药可及的靶标。那些长期被认为无药可及的靶标。那些长期被认为无药可及的靶标。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】鉴定小分子靶标的高通量筛选方法
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2020年5月11日提交的美国临时专利申请序列号63/023,181的优先权，该申请以其整体通过引用并入本文。
[0003]专利技术背景
[0004]靶向细胞内的生物过程以进行药物干预是药物发现的主要目标。鉴定针对特定靶蛋白的抑制性药物的过程必须满足以下要求：对靶标的高亲和力、对靶效应的高效力和选择性、以及确定剂量，该剂量在预想的组织保持足够高的药物浓度以维持想要的药理学效应，同时最小化毒性和不想要的脱靶效应。小分子是用于调控细胞内靶标的有吸引力的候选物，因为它们能够穿过质膜、进入广泛的组织和作用位点、同时影响多个靶标并且经济地大规模生产。
[0005]泛素
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蛋白酶体系统(UPS)是在真核生物物种中高度保守的内源性细胞内蛋白质降解系统。通过E3泛素连接酶对靶蛋白的多泛素化指定该靶蛋白随后被蛋白酶体(一种以蛋白水解方式分解其靶蛋白底物的多单元圆柱形结构)降解。这种高度调节的蛋白质降解系统对于细胞的稳态是至关重要的，并且在多种疾病状态中可能被破坏。选择这种天然蛋白质降解系统以在蛋白质水平上调控特定的疾病靶标是当前研究的一个活跃的领域，并且具有巨大的治疗潜力，尤其是对于长期被认为“无药可及(undruggable)”的靶标。
[0006]通过E3泛素连接酶将泛素分子转移到靶蛋白(底物)是通过底物识别和邻近两者所介导的。在天然的环境中，存在几个不同的底物识别机制，其中多数机制涉及降解决定子(degron)——靶蛋白上被E3泛素连接酶识别并介导连接酶和靶蛋白底物相互作用的短氨基酸序列或化学基序。靶蛋白N末端的N
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降解决定子可以通过蛋白水解切割显露并介导通过E3泛素连接酶进行的识别。通过靶蛋白的酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的磷酸化，磷酸化降解决定子转变成其活性的且被识别的形式。由于连接酶
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底物结合位点之间的稳定性，泛素连接酶可能仅识别磷酸化型式的底物——不识别未磷酸化的底物。此外，氧、小分子或底物的结构基序也可能影响降解决定子的识别。
[0007]先前的工作证明，已知与靶蛋白相互作用的小分子可以与已知与E3泛素连接酶相互作用的表位连接，介导靶蛋白和E3泛素连接酶之间基于邻近的相互作用，从而引发靶蛋白的细胞降解。所谓的“蛋白水解靶向嵌合体”或PROTAC证明了E3泛素连接酶和降解靶标之间三元复合物的人工稳定引起靶标的成功降解。PROTAC由通过接头连接的两个小分子组成。然而，大多数PROTAC相对高的分子质量、理化特性和药物特性使它们不适合于作为小分子药物的候选物。
[0008]最近，一类小分子已经显示出介导或诱导E3泛素连接酶与其靶蛋白底物之间的相互作用。沙利度胺(thalidomide)类似物，包括来那度胺(lenalidomide)和泊马度胺(pomalidomide)，与E3泛素连接酶CRL4
CRBN
结合并诱导多种靶标包括Ikaros(IKZF1)、Aiolos和CK1α的降解，具有令人惊讶的多功能性和选择性。其中，这些发现为鉴定可能激动化蛋白质
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蛋白质相互作用(例如，E3泛素连接酶和新的靶蛋白之间的相互作用)的小分子和鉴定治疗性靶标阐明了机会。例如，可以鉴定或设计小分子以化学诱导UPS介导的对传统
小分子抑制剂免疫的无药可及的蛋白质的降解。
[0009]本文公开的方法相比于现存的蛋白质
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蛋白质相互作用筛选方法(例如，噬菌体展示或酵母表面展示)包括几个明显的优势。第一，本文公开的方法容许文库对文库(library
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by
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library)筛选，即，以高通量的方式一同地查询一组多个潜在的蛋白质结合配偶体与另一组多个蛋白质结合配偶体之间的相互作用。由于现存的荧光报告物的光谱分辨率，噬菌体和酵母表面展示技术只能同时筛选对有限数量的靶标的结合。例如，此类技术将限于一次仅筛选几个E3泛素连接酶的靶标。本文公开的方法能够在单个测定中一次筛选许多E3泛素连接酶的许多变体的靶标。
[0010]第二，本文公开的方法在非常精细的分辨率水平上提供了相互作用强度的定量结果。现存的方法可能仅限于检测超过研究人员建立的特定阈值的强相互作用，并且可能仅富集那些强相互作用。本文公开的方法可以检测潜在的蛋白质结合配偶体变体之间结合亲和力的细微的调控，例如，在筛选一个蛋白质结合配偶体的位点饱和诱变(SSM)文库针对第二个蛋白质配偶体的位点饱和诱变(SSM)文库期间。本文公开的方法可以检测在结合界面的突变的适度和定量的影响，而通过其他筛选平台无法检测这些影响。另外，本文公开的方法尤其适用于检测和鉴定靶蛋白的潜在新底物，例如，E3泛素连接酶的新底物。E3泛素连接酶和先前未知的底物之间的相互作用代表了小分子发现和设计的有吸引力的候选物。
[0011]最后，本文公开的方法是高通量、快速并且有成本效益的。在通过本文公开的方法进行的大量文库对文库的研究中，所有的蛋白质结合配偶体都是经遗传编码并由酵母细胞产生的。不需要昂贵和费力的重组蛋白的表达和纯化。在单个测定中可以快速并经济地筛选出数千种潜在的相互作用。
[0012]基于上文所讨论的原因，因此需要合理的高通量方法来发现蛋白质结合配偶体对，例如，E3泛素连接酶与其靶蛋白底物，上述蛋白质结合配偶体对的相互作用可能适合由小分子进行的调节。在发现此类蛋白质结合配偶体对后，基于蛋白质
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蛋白质界面的晶体结构进行高通量小分子筛选活动和合理的药物设计。本文公开的方法满足以上需要。
[0013]专利技术概述
[0014]在一些实施方案中，提供了用于测定蛋白质
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蛋白质相互作用的方法，该方法包括：提供在第一多个重组单倍体酵母细胞的表面上表达和展示的多个多肽泛素连接酶种类，其中第一多个多肽泛素连接酶种类包含野生型多肽泛素连接酶种类和通过诱变在一个或多个氨基酸残基位置处经修饰的突变体多肽泛素连接酶种类的文库；提供在第二多个重组单倍体酵母细胞的表面上表达和展示的多个多肽底物种类，其中多个多肽底物种类包含野生型多肽底物种类和通过诱变在一个或多个氨基酸残基位置处经修饰的突变体多肽底物种类的文库；在液体培养基中组合第一多个重组单倍体酵母细胞和第二多个重组单倍体酵母细胞以产生培养物；使培养物在一定条件下生长一段时间，使得多个多肽泛素连接酶种类之中的一个或多个和多个多肽底物种类之中的一个或多个之间的一个或多个相互作用介导第一多个重组单倍体酵母细胞的一个或多个和第二多个重组单倍体酵母细胞的一个或多个之间的一个或多个交配事件以产生一个或多个二倍体酵母细胞；基于培养物中交配事件的数量，确定多个多肽泛素连接酶种类之中的一个或多个和多个多肽底物种类之中的一个或多个之间的相互作用的强度；以及鉴定多肽对，其中多肽泛素连接酶种类之一和多肽底物种类之一中的一个或两者通过诱变在一个或多个氨基酸残基位置处经修饰，并且
该多肽泛素连接酶种类和该多肽底物种类之间的相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于测定蛋白质
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蛋白质相互作用的方法，所述方法包括：提供在第一多个重组单倍体酵母细胞的表面上表达和展示的多个多肽泛素连接酶种类，其中第一多个多肽泛素连接酶种类包含野生型多肽泛素连接酶种类和通过诱变在一个或多个氨基酸残基位置处经修饰的突变体多肽泛素连接酶种类的文库；提供在第二多个重组单倍体酵母细胞的表面上表达和展示的多个多肽底物种类，其中所述多个多肽底物种类包含野生型多肽底物种类和通过诱变在一个或多个氨基酸残基位置处经修饰的突变体多肽底物种类的文库；在液体培养基中组合所述第一多个重组单倍体酵母细胞和所述第二多个重组单倍体酵母细胞以产生培养物；使所述培养物在一定条件下生长一段时间，使得所述多个多肽泛素连接酶种类之中的一个或多个和所述多个多肽底物种类之中的一个或多个之间的一个或多个相互作用介导所述第一多个重组单倍体酵母细胞的一个或多个和所述第二多个重组单倍体酵母细胞的一个或多个之间的一个或多个交配事件以产生一个或多个二倍体酵母细胞；基于所述培养物中交配事件的数量，确定所述多个多肽泛素连接酶种类之中的一个或多个和所述多个多肽底物种类之中的一个或多个之间的相互作用的强度；以及鉴定多肽对，其中所述多肽泛素连接酶种类之一和所述多肽底物种类之一中的一个或两者通过诱变在一个或多个氨基酸残基位置处经修饰，并且所述多肽泛素连接酶种类和所述多肽底物种类之间的相互作用的强度(K
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)比相应的野生型多肽种类之间的相互作用强或弱至少10％。2.如权利要求1所述的方法，其中所述多肽泛素连接酶种类和所述多肽底物种类之间的相互作用的强度(K
D
)比相应的野生型多肽种类之间的相互作用强或弱至少25％。3.如权利要求1所述的方法，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：D扬格，R洛佩兹，A森，R埃默森，
申请(专利权)人：A阿尔法生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：