一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用。利用oxyethyleneglycol bridge修饰引物通过PCR扩增获得的5

【技术实现步骤摘要】
一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物纳米材料领域，具体涉及一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用。

技术介绍

[0002]核酸特有的沃森
‑
克里克碱基配对特性，使其可作为构建各种纳米结构的元件。相比于传统纳米材料，核酸纳米材料具有序列可编程性、自动控制合成、稳定性高以及其本身的功能，从而广泛用于生物医疗、生物技术和纳米电化学中。
[0003]常见的核酸纳米结构如多面体、核酸纳米粒子、核酸纳米管、DNA折纸等，这些构建核酸纳米结构的方法均依赖于短的核酸链之间的沃森
‑
克里克碱基配对，然而，这些方法也存在一些缺点，如需要对核酸链进行复杂的设计，需制备大量的核酸链，核酸链间的空间位阻导致其结构不紧密，切口的存在使其易被核酸酶降解，变性等条件会导致其结构的解离从而破坏纳米结构的完整性。因此，需要一种不依赖于沃森
‑
克里克碱基配对作用，只需少量的不含有切口的核酸链来构建堆积紧密、多功能化的核酸纳米结构。
[0004]DNA纳米花是一种紧密堆积的非典型的层级的自组装结构，不依赖于沃森
‑
克里克碱基配对，在无机焦磷酸镁的存在下，利用DNA链与焦磷酸镁之间的相互作用，通过DNA液体结晶化、各向异性的有序组装而形成高浓度的多聚体。紧密堆积的DNA纳米花可用于装载各种功能基团，如药物和成像物质等，纳米花的形貌大小对于其应用具有重要作用。因此，对于纳米花形貌的调控的研究十分重要。
专利技术内容
[0005]本专利技术的目的是提供一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用。
[0006]为了实现本专利技术的目的，利用oxyethyleneglycol bridge修饰引物通过PCR扩增获得的5
’
端带有粘性末端的扩增子，以此为模板实现双链功能核酸纳米花的组装，且通过核酸定量分析方法，计算发现纳米花对双链核酸的装载率高达86％
‑
98％；进而通过调节双链功能核酸扩增子浓度、Mg
2+
浓度、焦磷酸根浓度，实现功能核酸纳米花的形貌调控。此外，利用功能核酸纳米花优良的比表面积和核酸特异性，实现了功能核酸纳米花高效捕获单链核酸靶标。
[0007]第一方面，本专利技术提供一种双链功能核酸纳米花的组装方法，用化学修饰的核酸引物对基因组进行PCR扩增获得扩增子，对所述PCR扩增子进行纯化，获得纯化子，以所述纯化子为模板进行双链功能核酸纳米花的组装；
[0008]所述的化学修饰的核酸引物为上游引物和下游引物；
[0009]上游引物1为序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列通过化学修饰基团连接后得到的引物；
[0010]上游引物1的序列为5
’‑
GGGGGGAAGAGGGAAGGTT
‑
oxyethyl eneglycol bridge
‑
TTGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA
‑3’
；
[0011]下游引物1为序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列通过化学修饰基团连接后得到的引物；
[0012]下游引物1的序列为5
’‑
GGGGGGAAGAGGGAAGGTT
‑
oxyethyl eneglycol bridge
‑
TTTCATCGCACCGTCAAAGGAACC
‑3’
；
[0013]所述的化学修饰基团为oxyethyleneglycol bridge，具体结构为：
[0014][0015]所述纯化方法为去除PCR扩增体系中的蛋白质、盐等非PCR产物；
[0016]优选地，纯化方法采用天根生化科技(北京)有限公司试剂盒(DP204
‑
02)对扩增产物进行纯化；
[0017]所述纯化子孵育是在30℃的金属浴中孵育18h进行高效组装，其中孵育体系是159μL ddH2O,20μL 10
×
PCR Buffer(Mg
2+
plus)，17μL Mg
2+
(100mM),2μL PPi(100mM)，2μL PCR纯化子。
[0018]随后，使用冷冻离心机于4℃下12000rpm/min离心30min，弃上清；加入20μL去离子水充分洗涤，于4℃下12000rpm/min离心30min，弃上清，用去离子水以上述方法洗涤两次后晾干过夜，通过扫描电镜观察双链功能核酸纳米花的形貌。
[0019]第二方面，本专利技术利用双链功能核酸纳米花对Tris
‑
HCl buffer(pH 5.0)不耐受，将制备好的纳米花样品使用Tris
‑
HCl buffer(pH 5.0)中进行溶解，建立双链功能核酸纳米花的核酸定量分析方法；
[0020]所述定量分析方法，首先使用10倍梯度稀释的纯化PCR扩增子(浓度为95.218ng/μL)为扩增模板，进行real time PCR的定量分析,SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(FP205天根生化科技(北京)有限公司)，PCR过程选用了25μL的PCR扩增体系，组分如下：
[0021][0022]其中，使用的上游引物2SEQ ID NO:4与下游引物2SEQ ID NO:5的序列分别为：
[0023]上游引物2SEQ ID NO:4：5
’‑
GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA
‑3’
[0024]下游引物2SEQ ID NO:5：5
’‑
TCATCGCACCGTCAAAGGAACC
‑3’
[0025]实验得到的real time PCR的扩增曲线，并依据其Ct值与扩增模板的浓度之间的线性关系绘制出标准曲线：y＝
‑
4.553x+16.507。
[0026]标准曲线绘制完毕后，即可定量分析纳米花对双链核酸的装载率。该过程使用双链功能核酸纳米花的Tris
‑
HCl buffer(0.05mM,pH 5.0)溶解物的10倍梯度稀释产物作为real time PCR的扩增模板，使用上游引物2SEQ ID NO:5与下游引物2SEQ ID NO:6作为real time PCR的扩增引物(PCR扩增体系同上)，进行real time PCR。通过测定的Ct值，带入上述标准曲线，计算得到双链功能核酸的浓度，进而计算得到纳米花对双链核酸的装载率高达86％
‑
98％。
[0027]第三方面，本专利技术提供一种双链功能核酸纳米花的形貌调控方法，用化学修饰的核酸引物对基因组进行PCR扩增获得扩增子，用所述PCR扩增子进行纯化，获得纯化子，以所述纯化子为模板通过本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双链功能核酸纳米花的组装方法，其特征在于：用核酸引物对基因组进行PCR扩增获得扩增子，对PCR扩增子进行纯化，获得纯化子，以所述纯化子为模板进行双链功能核酸纳米花的组装；所述双链功能核酸纳米花的组装是在20～40℃的金属浴中孵育15h以上，其中孵育体系参照如下比例：1
×
PCR Buffer(Mg
2+
plus)，5～15μMMg
2+
,0.25～5.00μMPPi，10～500ng/μLPCR纯化子，加入ddH2O补齐至200μL。2.一种双链功能核酸纳米花的形貌调控方法，其特征在于，用核酸引物对基因组进行PCR扩增获得扩增子，将PCR扩增子进行纯化，获得纯化子，以所述纯化子为模板通过调控纯化子浓度、Mg
2+
浓度、焦磷酸根浓度，实现功能核酸纳米花的形貌调控；所述纯化子的浓度范围在1.00pg/L～200μg/L；所述Mg
2+
浓度范围在0.10～...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文涛，田晶晶，贺晓云，朱龙佼，朱丽叶，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：