【技术实现步骤摘要】
DNA重组中的或与DNA重组相关的改进
[0001]本申请为国际申请日2016年8月5日、国际申请号PCT/EP2016/068782于2018年3月22日进入中国国家阶段、申请号201680055125.1、专利技术名称“DNA重组中的或与DNA重组相关的改进”的分案申请。
[0002]本专利技术总的来说涉及DNA重组，具体来说涉及一种用于生产DNA重组片段的方法，所述DNA重组片段具有靶DNA的基于重组的操作所需的与所述靶DNA内的所需遗传操作位点同源的必需的侧接区。因此，本专利技术涉及基于CrispR/Cas9、基于E/T和其他基于重组的技术，所述技术使用这些DNA片段作为它们的重组系统的组成部分。
技术介绍
[0003]重组的机制仍未被完全确定，但涉及DNA序列的拷贝、切割和共价连接。重组可以发生在两个不同DNA分子之间(分子间重组)或单个DNA分子的两个区域之间(分子内重组)。
技术实现思路
[0004]本专利技术提供了一种将所需遗传元件插入到任何靶基因组中的方法，所述方法包括将如本文中所述...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于构建异源遗传元件质粒载体的方法，所述质粒载体被配置用于在所需插入位点将异源遗传元件重组到靶基因组中，所述异源遗传元件质粒载体按照用于构建DNA重组片段的方法形成，所述DNA重组片段具有所述靶基因组的基于重组的操作所需的与所述靶基因组内的用于遗传操作的所述所需插入位点同源的必需的侧接区，所述用于构建异源遗传元件质粒载体的方法包括下述步骤：A)鉴定所述靶基因组中用于遗传元件的所需插入位点；B)对存在于待靶向用于遗传操作的所述靶基因组内所述位点上游的所选限制性内切核酸酶的内源的、本源的半位点进行定位，并由此确定上游同源区的5'范围，其中所述所选限制性内切核酸酶是稀有切点切割酶，其中所述稀有切点切割酶是至少8个核苷酸的切割酶；C)对存在于待靶向用于遗传操作的所述靶基因组内所述位点下游的同一所选稀有切点切割酶的内源的、本源的半位点进行定位，并由此确定下游同源区的3'范围；D)合成侧接区基因盒(FRC)，其引起上游半位点和下游半位点的并置，从而导致形成侧接有所述上游同源区和下游同源区的所选限制性内切核酸酶的完整限制性位点，其中所述FRC通过不依赖于PCR的DNA合成技术来合成；E)将所述FRC插入到包含用于操作所述靶病毒基因组的异源遗传元件的质粒载体中以形成异源遗传元件质粒载体，并且后续通过使用所述所选限制性内切核酸酶在所述FRC内切开来将所述异源遗传元件质粒载体线性化，在所述异源遗传元件质粒载体上提供所述必需的侧接同源区，从而允许在所述所需插入位点处在所述靶病毒基因组内的后续重组。2.一种用于构建异源遗传元件质粒载体的方法，所述质粒载体被配置用于在所需插入位点将异源遗传元件重组到靶基因组中，所述异源遗传元件质粒载体按照用于构建DNA重组片段的方法形成，所述DNA重组片段具有所述靶基因组的基于重组的操作所需的与所述靶基因组内的用于遗传操作的所述所需插入位点同源的必需的侧接区，所述用于构建异源遗传元件质粒载体的方法包括下述步骤：A)鉴定所述靶基因组中用于遗传元件的所需插入位点；B)选择所选限制性内切核酸酶的异源的、非本源的半位点，其中限制性位点的选择是基于在与待靶向的所述插入位点侧接的上游同源区和下游同源区内不存在完整形式的所述所选限制性位点；C)合成侧接区基因盒(FRC)，其引起上游半位点和下游半位点的并置，从而导致形成侧接有所述上游同源区和下游同源区的所选限制性内切核酸酶的完整限制性位点，其中所述FRC通过不依赖于PCR的DNA合成技术来合成；E)将所述FRC插入到包含用于操作所述靶病毒基因组的异源遗传元件的质粒载体中以形成异源遗传元件质粒载体，并且后续通过使用所述所选限制性内切核酸酶在所述FRC内切开来将所述异源遗传元件质粒载体线性化，在所述异源遗传元件质粒载体上提供所述必需的侧接同源区，从而允许在所述所需插入位点处在所述靶病毒基因组内的后续重组。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述FRC的上游同源区和下游同源区以与它们在所述靶基因组中存在的顺序相反的顺序出现，使得在它们的接合处形成所述限制性位点。4.一种用于构建DNA重组片段的不基于PCR的方法，所述DNA重组片段具有靶DNA的基于
重组的操作所需的与所述靶DNA内的所需遗传操作位点同源的必需的侧接区，所述方法包括下述步骤：A)鉴定所述靶DNA中用于遗传元件的所需插入位点；B)对存在于待靶向用于遗传操作的DNA内所述位点上游的所选限制性内切核酸酶的内源的、本源的...
【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：
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