本申请涉及胞嘧啶修饰的免亚硫酸氢盐的碱基分辨率鉴定。本公开提供了用于在核酸序列中以免亚硫酸氢盐的方式鉴定5
【技术实现步骤摘要】
测序(BS)以及其衍生方法,诸如Tet辅助的亚硫酸氢盐测序(TAB
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Seq)和氧化性亚 硫酸氢盐测序(oxBS)。所有这些方法均采用亚硫酸氢盐处理,以将未甲基化的胞嘧啶 转化为尿嘧啶,同时保持5mC和/或5hmC完整。通过亚硫酸氢盐处理的DNA的PCR 扩增,将尿嘧啶读作胸腺嘧啶,可以以单碱基分辨率推断出每个胞嘧啶的修饰信息(其 中C到T的转变提供未甲基化的胞嘧啶的位置)。然而,亚硫酸氢盐测序存在至少两个 主要缺点。首先,亚硫酸氢盐处理是苛刻的化学反应,由于在所需的酸性和温度条件下 进行脱嘌呤处理,它降解超过90%的DNA。这种降解严重限制了其在低输入样品中的 应用,诸如包括循环游离DNA和单细胞测序在内的临床样品。其次,亚硫酸氢盐测序 依赖于未修饰胞嘧啶向胸腺嘧啶的完全转化。未修饰胞嘧啶占人基因组中总胞嘧啶的大 约95%。将所有这些位置转化为胸腺嘧啶大大降低序列复杂性,从而导致测序质量差、 定位率低、基因组覆盖度不均匀和测序成本增加。由于未修饰的胞嘧啶不完全转化为胸 腺嘧啶,亚硫酸氢盐测序方法还容易存在5mC和5hmC的误检。
[0010]亚硫酸氢盐测序还已用于检测RNA中的胞嘧啶甲基化。与用于检测RNA中的5mC 的其他方法(诸如甲基化RNA免疫沉淀)不同,RNA亚硫酸氢盐测序(RNA
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BS
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seq) 的优势在于能够确定RNA中特定C位置的甲基化程度。然而,RNA
‑
BS
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seq存在与上文 针对DNA的亚硫酸氢盐测序所描述的相同缺点。特别地,反应条件可引起RNA的大量 降解。
[0011]需要一种用于DNA甲基化和羟甲基化分析的方法,所述方法是一种温和反应,可 以在不影响未修饰胞嘧啶的情况下以碱基分辨率定量地检测修饰的胞嘧啶(5mC和 5hmC)。同样,需要一种用于RNA甲基化和羟甲基化分析的方法,所述方法采用温和 的反应条件,并且可以在不影响未修饰胞嘧啶的情况下以碱基分辨率定量地检测修饰的 胞嘧啶。
技术实现思路
[0012]本专利技术提供了用于鉴定5
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甲基胞嘧啶、5
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羟甲基胞嘧啶、5
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羧基胞嘧啶和/或5
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甲酰 基胞嘧啶中的一个或多个在核酸中的位置的方法。本文所述的方法提供了涉及温和反应 的DNA或RNA甲基化和羟甲基化分析,其在不影响未修饰胞嘧啶的情况下以碱基分辨 率定量地检测修饰的胞嘧啶。本文提供了一种用于鉴定5mC和5hmC的新方法,其通过 结合TET氧化和通过硼烷衍生物(例如,吡啶硼烷和2
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甲基吡啶硼烷(pic
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BH3))进 行的还原来实现,在本文称为TAPS(TET辅助的吡啶硼烷测序)(表1)。TAPS以高 灵敏度和特异性直接检测修饰,而不影响未修饰的胞嘧啶,并且可以采用以检测其他胞 嘧啶修饰。所述方法是非破坏性的,保留最多长10kb的RNA和DNA。与亚硫酸氢盐 测序相比,TAPS实现更高的定位率、更均匀的覆盖度和更低的测序成本,从而能够实 现更高质量、更全面且更便宜的甲基化组分析。如本文所述,使用不采用氧化步骤的该 方法的变型鉴定5fC和/或5caC。
[0013]在一个方面,本专利技术提供了一种用于鉴定靶核酸中的5
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甲基胞嘧啶(5mC)的方法, 包括以下步骤:
[0014]a.提供包含靶核酸的核酸样品;
[0015]b.对核酸进行修饰,包括以下步骤:
[0016]i.在核酸样品中的5
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羟甲基胞嘧啶(5hmC)上添加封端基团;
[0017]ii.将核酸样品中的5mC转化为5
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羧基胞嘧啶(5caC)和/或5
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甲酰基胞嘧啶(5fC); 以及
[0018]iii.将5caC和/或5fC转化为二氢尿嘧啶(DHU)以提供包含修饰的靶核酸的修饰的 核酸样品;以及
[0019]c.检测修饰的靶核酸的序列;其中与靶核酸相比,修饰的靶核酸的序列中胞嘧啶 (C)到胸腺嘧啶(T)的转变提供5mC在靶核酸中的位置。
[0020]在用于鉴定靶核酸中的5mC的方法的实施方案中,每个转变位置处的T的百分比 提供靶核酸中的每个位置处的5mC的定量水平。在实施方案中,核酸是DNA。在其他 实施方案中,核酸是RNA。
[0021]在另一方面,本专利技术提供了一种用于鉴定靶核酸中的5mC或5hmC的方法,包括以 下步骤:
[0022]a.提供包含靶核酸的核酸样品;
[0023]b.对核酸进行修饰,包括以下步骤:
[0024]i.将核酸样品中的5mC和5hmC转化为5
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羧基胞嘧啶(5caC)和/或5fC;以及
[0025]ii.将5caC和/或5fC转化为DHU以提供包含修饰的靶核酸的修饰的核酸样品;以 及
[0026]c.检测修饰的靶核酸的序列;其中与靶核酸相比,修饰的靶核酸的序列中胞嘧啶 (C)到胸腺嘧啶(T)的转变提供5mC或5hmC在靶核酸中的位置。
[0027]在用于鉴定5mC或5hmC的方法的实施方案中,每个转变位置处的T的百分比提 供靶核酸中的每个位置处的5mC或5hmC的定量水平。在实施方案中,核酸是DNA。 在其他实施方案中,核酸是RNA。
[0028]在另一方面,本专利技术提供了一种用于鉴定靶核酸中的5mC和鉴定靶核酸中的5hmC 的方法,包括以下步骤:
[0029]a.鉴定靶核酸中的5mC,包括以下步骤:
[0030]i.提供包含靶核酸的第一核酸样品;
[0031]ii.对第一样品中的核酸进行修饰,包括以下步骤:
[0032]1.在第一核酸样品中的5
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羟甲基胞嘧啶(5hmC)上添加封端基团;
[0033]2.将第一核酸样品中的5mC转化为5caC和/或5fC;以及
[0034]3.将5caC和/或5fC转化为DHU,以提供包含修饰的靶核酸的修饰的第一DNA样 品;
[0035]iii.任选地扩增修饰的靶核酸的拷贝数;以及
[0036]iv.检测修饰的靶核酸的序列;其中与靶核酸相比,修饰的靶核酸的序列中胞嘧啶 (C)到胸腺嘧啶(T)的转变提供5mC在靶核酸中的位置。
[0037]b.鉴定靶核酸中的5mC或5hmC,包括以下步骤:
[0038]i.提供包含靶核酸的第二核酸样品;
[0039]ii.对第二样品中的核酸进行修饰,包括以下步骤:
[0040]1.将第二核酸样品中的5mC和5hmC转化为5caC和/或5fC;以及
[0041]2.将5caC和/或5fC转化为DHU,以提供包含修饰的靶核酸的修饰的第二核酸样 品;
[0042]iii.任选地扩增修饰的靶核酸的拷贝数;
[0043]iv.检测来自第二样品的修饰的靶核酸的序列;其中与靶核酸相比,修饰的靶核酸的 序列中胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的转变本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定靶核酸中的5
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甲基胞嘧啶(5mC)或5
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羟甲基胞嘧啶(5hmC)的方法,包括以下步骤:提供包含所述靶核酸的核酸样品;对所述靶核酸进行修饰,包括以下步骤:通过使所述核酸样品与10
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11易位(TET)酶接触以产生一种或多种5
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羧基胞嘧啶(5caC)或5
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甲酰基胞嘧啶(5fC)残基,将所述核酸样品中的所述5mC和5hmC转化为5caC和/或5fC;以及通过用硼烷还原剂处理所述靶核酸,将所述5caC和/或5fC转化为二氢尿嘧啶(DHU),以提供修饰的核酸样品,所述修饰的核酸样品包含修饰的靶核酸;以及检测所述修饰的靶核酸的序列;其中与所述靶核酸相比,所述修饰的靶核酸的序列中胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的转变或胞嘧啶(C)到DHU的转变提供所述靶核酸中5mC或5hmC的位置。2.如权利要求1所述的方法,其中所述硼烷还原剂是2
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甲基吡啶硼烷。3.如权利要求1所述的方法,其中检测所述修饰的靶核酸的序列的步骤包含链终止测序、微阵列、高通量测序和限制性酶分析中的一种或多种。4.如权利要求1所述的方法,其中所述TET酶选自由人TET1、TET2和TET3;鼠Tet1、Tet2和Tet3;纳氏虫属TET(NgTET);以及灰盖鬼伞(CcTET)组成的组。5.如权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员:宋春啸,刘艺斌,
申请(专利权)人:路德维格癌症研究院,
类型:发明
国别省市:
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