胞嘧啶修饰的免亚硫酸氢盐的碱基分辨率鉴定制造技术

本公开提供了用于在核酸序列中以免亚硫酸氢盐的方式鉴定5‑甲基胞嘧啶、5‑羟甲基胞嘧啶、5‑羧基胞嘧啶和5‑甲酰基胞嘧啶的位置的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】胞嘧啶修饰的免亚硫酸氢盐的碱基分辨率鉴定相关申请的交叉引用本申请要求于2018年1月8日提交的美国临时申请号62/614,798、2018年4月20日提交的美国临时申请号62/660,523和2018年11月26日提交的美国临时申请号62/771,409的权益，其中的每一个以引用方式全文并入本文。
本公开提供了用于在核酸序列中鉴定5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-羧基胞嘧啶和/或5-甲酰基胞嘧啶的位置的方法。
技术介绍
5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是在哺乳动物基因组中发现的两个主要表观遗传标记。5hmC通过10-11易位(TET)家族双加氧酶由5mC生成。Tet可以将5hmC进一步氧化为5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)，与5mC和5hmC相比，其在哺乳动物基因组中以低得多的丰度存在(比5hmC低10倍至100倍)。总体来说，5mC和5hmC在从基因调控到正常发育的广泛生物过程中起着关键作用。异常的DNA甲基化和羟甲基化已与各种疾病相关联，并且是癌症的公认标志。因此，DNA序列中的5mC和5hmC的确定不仅对基础研究至关重要，而且对包括诊断和治疗在内的临床应用也很有价值。5fC和5caC是5mC的两种最终氧化衍生物，并且可以在碱基切除修复途径中通过胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)转化为未修饰的胞嘧啶。因此，5fC和5caC是活性脱甲基过程中的两种重要的关键中间体，其在胚胎发育中起着重要作用。5fC和5caC在这些背景下是存在的并且可用作5mC几乎完全脱甲基的指标。5fC和5caC也可发挥其他作用，诸如结合特定蛋白质并影响RNA聚合酶II的速率和特异性。5mC还是已经在稳定且高丰度的tRNA和rRNA中以及mRNA中得到鉴定的转录后RNA修饰。此外，已经在snRNA(小核RNA)、miRNA(微RNA)、lncRNA(长的非编码RNA)和eRNA(增强子RNA)中检测到5mC。然而，在不同生物体中，5mC在特定RNA类型中的出现似乎有所不同。例如，5mC在来自细菌的tRNA和mRNA中似乎不存在，却存在于真核生物和古细菌的tRNA和mRNA中。在RNA中也检测到了5hmC。例如，发现来自果蝇和小鼠的mRNA含有5hmC。据报道，在DNA中氧化5mC的同一家族的酶在哺乳动物总RNA中催化5hmC的形成。在蝇类中，使用甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)与5hmC抗体进行的全转录组研究(transcriptomewidestudy)在许多mRNA编码序列中检测到5hmC的存在，其中脑中的水平特别高。还有报道称，主动翻译与RNA中5hmC的高水平相关联，并且缺乏负责RNA中的5hmC沉积的TET酶的蝇类的脑发育受损。目前用于DNA甲基化和羟甲基化分析的金标准和最广泛使用的方法是亚硫酸氢盐测序(BS)以及其衍生方法，诸如Tet辅助的亚硫酸氢盐测序(TAB-Seq)和氧化性亚硫酸氢盐测序(oxBS)。所有这些方法均采用亚硫酸氢盐处理，以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，同时保持5mC和/或5hmC完整。通过亚硫酸氢盐处理的DNA的PCR扩增，将尿嘧啶读作胸腺嘧啶，可以以单碱基分辨率推断出每个胞嘧啶的修饰信息(其中C到T的转变提供未甲基化的胞嘧啶的位置)。然而，亚硫酸氢盐测序存在至少两个主要缺点。首先，亚硫酸氢盐处理是苛刻的化学反应，由于在所需的酸性和温度条件下进行脱嘌呤处理，它降解超过90％的DNA。这种降解严重限制了其在低输入样品中的应用，诸如包括循环游离DNA和单细胞测序在内的临床样品。其次，亚硫酸氢盐测序依赖于未修饰胞嘧啶向胸腺嘧啶的完全转化。未修饰胞嘧啶占人基因组中总胞嘧啶的大约95％。将所有这些位置转化为胸腺嘧啶大大降低序列复杂性，从而导致测序质量差、定位率低、基因组覆盖度不均匀和测序成本增加。由于未修饰的胞嘧啶不完全转化为胸腺嘧啶，亚硫酸氢盐测序方法还容易存在5mC和5hmC的误检。亚硫酸氢盐测序还已用于检测RNA中的胞嘧啶甲基化。与用于检测RNA中的5mC的其他方法(诸如甲基化RNA免疫沉淀)不同，RNA亚硫酸氢盐测序(RNA-BS-seq)的优势在于能够确定RNA中特定C位置的甲基化程度。然而，RNA-BS-seq存在与上文针对DNA的亚硫酸氢盐测序所描述的相同缺点。特别地，反应条件可引起RNA的大量降解。需要一种用于DNA甲基化和羟甲基化分析的方法，所述方法是一种温和反应，可以在不影响未修饰胞嘧啶的情况下以碱基分辨率定量地检测修饰的胞嘧啶(5mC和5hmC)。同样，需要一种用于RNA甲基化和羟甲基化分析的方法，所述方法采用温和的反应条件，并且可以在不影响未修饰胞嘧啶的情况下以碱基分辨率定量地检测修饰的胞嘧啶。
技术实现思路
本专利技术提供了用于鉴定5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-羧基胞嘧啶和/或5-甲酰基胞嘧啶中的一个或多个在核酸中的位置的方法。本文所述的方法提供了涉及温和反应的DNA或RNA甲基化和羟甲基化分析，其在不影响未修饰胞嘧啶的情况下以碱基分辨率定量地检测修饰的胞嘧啶。本文提供了一种用于鉴定5mC和5hmC的新方法，其通过结合TET氧化和通过硼烷衍生物(例如，吡啶硼烷和2-甲基吡啶硼烷(pic-BH3))进行的还原来实现，在本文称为TAPS(TET辅助的吡啶硼烷测序)(表1)。TAPS以高灵敏度和特异性直接检测修饰，而不影响未修饰的胞嘧啶，并且可以采用以检测其他胞嘧啶修饰。所述方法是非破坏性的，保留最多长10kb的RNA和DNA。与亚硫酸氢盐测序相比，TAPS实现更高的定位率、更均匀的覆盖度和更低的测序成本，从而能够实现更高质量、更全面且更便宜的甲基化组分析。如本文所述，使用不采用氧化步骤的该方法的变型鉴定5fC和/或5caC。在一个方面，本专利技术提供了一种用于鉴定靶核酸中的5-甲基胞嘧啶(5mC)的方法，包括以下步骤：a.提供包含靶核酸的核酸样品；b.对核酸进行修饰，包括以下步骤：i.在核酸样品中的5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)上添加封端基团；ii.将核酸样品中的5mC转化为5-羧基胞嘧啶(5caC)和/或5-甲酰基胞嘧啶(5fC)；以及iii.将5caC和/或5fC转化为二氢尿嘧啶(DHU)以提供包含修饰的靶核酸的修饰的核酸样品；以及c.检测修饰的靶核酸的序列；其中与靶核酸相比，修饰的靶核酸的序列中胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的转变提供5mC在靶核酸中的位置。在用于鉴定靶核酸中的5mC的方法的实施方案中，每个转变位置处的T的百分比提供靶核酸中的每个位置处的5mC的定量水平。在实施方案中，核酸是DNA。在其他实施方案中，核酸是RNA。在另一方面，本专利技术提供了一种用于鉴定靶核酸中的5mC或5hmC的方法，包括以下步骤：a.提供包含靶核酸的核酸样品；b.对核酸进行修饰，包括以下步骤：i.将核酸样品中的5mC和5hmC转化为5-羧基胞嘧啶(5caC)和/或5fC；以及ii.将5caC和/或5fC转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴定靶核酸中的5-甲基胞嘧啶(5mC)的方法，包括以下步骤：/na.提供包含所述靶核酸的核酸样品；/nb.对所述核酸进行修饰，包括以下步骤：/ni.在DNA样品中的所述5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)上添加封端基团；/nii.将所述核酸样品中的所述5mC转化为5-羧基胞嘧啶(5caC)和/或5-甲酰基胞嘧啶(5fC)；以及/niii.将所述5caC和/或所述5fC转化为二氢尿嘧啶(DHU)，以提供包含修饰的靶核酸的修饰的核酸样品；以及/nc.检测所述修饰的靶核酸的序列；/n其中与所述靶核酸相比，所述修饰的靶核酸的序列中胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的转变提供所述靶核酸中5mC的位置。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180108 US 62/614,798;20180420 US 62/660,523;20181.一种用于鉴定靶核酸中的5-甲基胞嘧啶(5mC)的方法，包括以下步骤：
a.提供包含所述靶核酸的核酸样品；
b.对所述核酸进行修饰，包括以下步骤：
i.在DNA样品中的所述5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)上添加封端基团；
ii.将所述核酸样品中的所述5mC转化为5-羧基胞嘧啶(5caC)和/或5-甲酰基胞嘧啶(5fC)；以及
iii.将所述5caC和/或所述5fC转化为二氢尿嘧啶(DHU)，以提供包含修饰的靶核酸的修饰的核酸样品；以及
c.检测所述修饰的靶核酸的序列；
其中与所述靶核酸相比，所述修饰的靶核酸的序列中胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的转变提供所述靶核酸中5mC的位置。


2.如权利要求1所述的方法，其中每个转变位置处的T的百分比提供所述靶核酸中的每个位置处的5mC的定量水平。


3.一种用于鉴定靶核酸中的5mC或5hmC的方法，包括以下步骤：
a.提供包含所述靶核酸的核酸样品；
b.对所述核酸进行修饰，包括以下步骤：
i.将所述核酸样品中的所述5mC和所述5hmC转化为5-羧基胞嘧啶(5caC)和/或5fC；以及
ii.将所述5caC和/或所述5fC转化为二氢尿嘧啶(DHU)，以提供包含修饰的靶核酸的修饰的核酸样品；以及
c.检测所述修饰的靶核酸的序列；
其中与所述靶核酸相比，所述修饰的靶核酸的序列中胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的转变提供所述靶核酸中5mC或5hmC的位置。


4.如权利要求3所述的方法，其中每个转变位置处的T的百分比提供所述靶核酸中的每个位置处的5mC或5hmC的定量水平。


5.一种鉴定靶核酸中的5mC和鉴定靶核酸中的5hmC的方法，包括：
a.鉴定所述靶核酸中的5-甲基胞嘧啶(5mC)，包括以下步骤：
i.提供包含所述靶核酸的第一核酸样品；
ii.对所述第一样品中的所述核酸进行修饰，包括以下步骤：
1.在所述第一核酸样品中的所述5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)上添加封端基团；
2.将所述第一核酸样品中的所述5mC转化为5caC和/或5fC；以及
3.将所述5caC和/或所述5fC转化为二氢尿嘧啶(DHU)，以提供包含修饰的靶核酸的修饰的第一核酸样品；
iii.任选地扩增所述修饰的靶核酸的拷贝数；以及
iv.检测所述修饰的靶核酸的序列；其中与所述靶核酸相比，所述修饰的靶核酸的序列中胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的转变提供所述靶核酸中5mC的位置；
b.鉴定所述靶核酸中的5mC或5hmC，包括以下步骤：
i.提供包含所述靶核酸的第二核酸样品；
ii.对所述第二样品中的所述核酸进行修饰，包括以下步骤：
1.将所述第二核酸样品中的所述5mC和所述5hmC转化为5caC和/或5fC；以及
2.将所述5caC和/或所述5fC转化为二氢尿嘧啶(DHU)，以提供包含修饰的靶核酸的修饰的第二核酸样品；
iii.任选地扩增所述修饰的靶核酸的拷贝数；以及
iv.检测来自所述第二样品的所述修饰的靶核酸的序列；其中与所述靶核酸相比，所述修饰的靶核酸的序列中胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的转变提供所述靶核酸中5mC或5hmC的位置；以及
c.比较步骤(a)和(b)的结果，其中步骤(b)中存在但步骤(a)中不存在的C到T的转变提供所述靶核酸中5hmC的位置。


6.如权利要求5所述的方法，其中在步骤(a)中，每个转变位置处的T的百分比提供所述靶核酸中的每个位置处的5mC的定量水平；在步骤(b)中，每个转变位置处的T的百分比提供所述靶核酸中的每个位置处的5mC或5hmC的定量水平；并且在步骤(c)中，在步骤(b)中鉴定但在步骤(a)中未鉴定的C到T转变的百分比差异提供所述靶核酸中的每个位置处的5hmC的定量水平。


7.根据权利要求1-2或权利要求5-6中任一项所述的方法，其中添加到5hmC上的所述封端基团是糖。


8.如权利要求7所述的方法，其中所述糖是葡萄糖或修饰的葡萄糖。


9.如权利要求7所述的方法，其中通过在葡糖基转移酶的存在下使所述核酸样品与连接至糖的UDP接触来将所述封端基团添加到所述5hmC上。


10.如权利要求9所述的方法，其中所述葡糖基转移酶选自由T4噬菌体β-葡糖基转移酶(βGT)、T4噬菌体α-葡糖基转移酶(αGT)以及其衍生物和类似物组成的组。

【专利技术属性】
技术研发人员：宋春啸，刘艺斌，
申请(专利权)人：路德维格癌症研究院，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH