基于NanoSPR生物芯片的定性或定量检测人或动物体内中和抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于NanoSPR生物芯片的定量检测人或动物体内中和抗体的方法，涉及新冠病毒检测技术领域；采用两步法，先在集成有NanoSPR生物芯片的芯片微孔板上孵育、修饰病毒片段蛋白或受体蛋白；再将不同浓度的待测样本稀释液加至芯片微孔板的每个微孔中；使用酶标仪记录数据初始状态检测值；最后相应地加入用受体蛋白或病毒片段蛋白标记的胶体金；反应结束后，采用酶标仪记录数据完成检测。本方法能够检测人或动物的大部分传染病类病原微生物或病毒载体的中和抗体，相比ELISA方法，本方法整个检测阶段耗时不超过30min，无需反复加样和洗板，可实现高通量、快速、超灵敏度的中和抗体检测。抗体检测。抗体检测。

【技术实现步骤摘要】
基于NanoSPR生物芯片的定性或定量检测人或动物体内中和抗体的方法


[0001]本专利技术涉及中和抗体检测
，特别涉及基于NanoSPR生物芯片的定性或定量检测人或动物体内中和抗体的方法。

技术介绍

[0002]新冠病毒超快的变异速度，以及超强的传播力和致病力，给疫情防控和抗疫科学研究都带来了不小的挑战。为了快速适应新冠肺炎流行变异株的常态化防控，变异株疫苗和中和抗体药物的开发依旧是两个重要的方向。中和抗体(Nautralizing Antibody)是一种自然产生的抗体，是人体免疫系统反应的一部分；可由感染或疫苗接种触发，用于抑制或破坏侵入人体的外来因素的影响。中和抗体除了能够直接与病毒结合，阻止它们感染细胞以外，还是变异株新疫苗研发、临床评价、疫苗接种后有效性评估的重要的指标之一。
[0003]为了判断疫苗接种的效果(针对COVID
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19的任意疫苗)，衡量社会的免疫力，检测先前感染者的免疫状态，寻找抗血清捐赠者(捐赠给ICU重症患者)，助力变异株疫苗的研发与临床评价，目前检测中和抗体的金标准是感染抑制试验，主要包括利用活病毒进行的蚀斑减少中和试验(plaquereduction neutralizationtest，PRNT)，以及通过检测细胞病变量(cytopathic effect，CPE)来进行分析的微量细胞中和试验。这两种试验方法均具有感染性，需要在高安全性的P3实验室(生物安全防护三级实验室，简称P3实验室，P代表Physical containment。整个实验室完全密封，室内处于负压状态，从而使实验室内部的气体不会泄漏到外面而造成污染)中进行。
[0004]纳米等离子体共振(NanoSPR)检测技术，是在纳米等离子体共振生物芯片上制作出直径不超过500nm的纳米孔阵列，通过入射光与金属纳米孔结构的共振耦合，利用表面等离子体共振的波长对于纳米结构周围介电环境的敏感性，实现对生化反应的检测。当吸附分子的折射率与周围环境的折射率存在差异时，吸附于基底表面的生物分子与目标分子的反应会改变基底表面的折射率，从而引起共振峰的变化，实现目标待测物质的检测。因此，纳米表面等离子体传感器的共振分析过程无需使用传统SPR技术那样的复杂光学系统。
[0005]目前，市面上还未发现有利用纳米等离子体共振检测技术进行中和抗体的定性/定量检测的方法。

技术实现思路

[0006]针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于NanoSPR生物芯片的定性或定量检测人或动物体内中和抗体的方法，可实现无需洗板的一步式操作，无需任何预防措施。该测试可用于一般自动化检测，只需30min即可得出检测结果，检测具有较高的灵敏度和准确度，检测过程简单、快速。具体通过以下技术实现。
[0007]基于NanoSPR生物芯片的定量检测人或动物体内中和抗体的方法，包括以下步骤：
[0008]S1、取集成有纳米等离子共振生物芯片的芯片微孔板(例如48、96或192 孔的芯片
微孔板)，在每个微孔的NanoSPR生物芯片上孵育、修饰病毒片段蛋白或受体蛋白；将待测样本梯度稀释后待用；
[0009]S2、将步骤S1制备的待测样本梯度稀释液加入到步骤S1所得的芯片微孔板中反应；用酶标仪记录数据初始状态检测值；反应一段时间后，在芯片微孔板中加入标记有受体蛋白或病毒片段的胶体金溶液进行反应，反应结束后用酶标仪记录终点状态检测值；
[0010]所述中和抗体为病原微生物侵入人或动物体内时产生的具有相应的中和能力的抗体，所述病原微生物为传染病类病原微生物或病毒载体；所述受体蛋白是与病毒片段蛋白特异性结合的蛋白。
[0011]上述检测方法，利用待测样品中的中和抗体、受体蛋白标记胶体金颗粒分别与纳米等离子共振生物芯片上的病毒片段蛋白进行竞争结合，建立了一种替代病毒中和试验，与物种无关的方式检测靶向病毒刺突(S)蛋白受体结合域的总免疫显性中和抗体。以新冠病毒为例，我们简单快速的测试基于抗体介导的血管紧张素转换酶2(ACE2)受体蛋白与受体结合域(RBD)之间相互作用的阻断。采用上述一步式检测方法，可以直接用光谱仪进行检测，不需要进行洗涤、甩干等操作，极大节省了检测时间，提高了检测效率，灵敏度较高。
[0012]优选地，步骤S1具体为：取集成有NanoSPR生物芯片的芯片微孔板，在每个微孔的NanoSPR生物芯片上先用病毒片段蛋白或受体蛋白进行第一次孵育，孵育温度4
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37℃，孵育时间2
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24h；用缓冲液清洗并氮气吹干后，加入酪蛋白封闭液进行第二次孵育，孵育温度4
‑
37℃，孵育时间0.5
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2h；用缓冲液清洗并氮气吹干后，备用；将待测样本用稀释液梯度稀释后待用。
[0013]优选地，步骤S3中，样本稀释液是质量分数2％NaCl的PBST缓冲液。
[0014]优选地，步骤S2中，标记有受体蛋白或病毒片段蛋白的胶体金溶液的制备方法具体为：取1ml胶体金溶液，加入6
‑
20μL 0.1M碳酸钾溶液，混匀；然后加入1
‑
10μg受体蛋白或病毒片段蛋白混匀、静置；再加入5
‑
15μL10％的PEG 20000 混匀，静置；冷冻离心，去上清后取沉淀加入100
‑
500μL复溶液混匀。
[0015]更优选地，步骤S2中制备标记有受体蛋白或病毒片段蛋白的胶体金溶液时，冷冻离心的条件为2
‑
8℃、7000
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10000rpm离心20
‑
40min。
[0016]进一步优选地，步骤S2中制备标记有受体蛋白或病毒片段蛋白的胶体金溶液时，所述复溶液是含有质量分数1
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5％的蔗糖、质量分数1
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5％葡萄糖、质量分数0.5
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4％甘露醇、质量分数0.1
‑
5％BSA的PBST缓冲液。
[0017]优选地，所述传染病类病原微生物为传染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰质炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血热、狂犬病、流行性乙型脑炎、登革热、炭疽、细菌性和阿米巴性痢疾、肺结核、伤寒和副伤寒、流行性脑脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生儿破伤风、猩红热、布鲁氏菌病、淋病、梅毒、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、人感染H7N9禽流感、新型冠状病毒肺炎；所述病毒载体为腺病毒、腺相关病毒、慢病毒。
[0018]基于NanoSPR生物芯片的定量检测的原理，上述传染病类病原微生物或病毒载体，都可以基于相应的中和抗体进行检测。
[0019]优选地，所述中和抗体为抗SARS
‑
COV
‑
2中和抗体(例如抗 SARS
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COV
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2Omicron变异株中和抗体、抗SARS
‑
COV
‑
2Delta变异株中和抗体) 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于NanoSPR生物芯片的检测人或动物体内中和抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、取集成有纳米等离子共振生物芯片的芯片微孔板，在每个微孔的NanoSPR生物芯片上孵育、修饰病毒片段蛋白或受体蛋白；将待测样本梯度稀释后待用；S2、将步骤S1制备的待测样本梯度稀释液加入到步骤S1所得的芯片微孔板中反应；用酶标仪记录数据初始状态检测值；反应一段时间后，在芯片微孔板中加入标记有受体蛋白或病毒片段的胶体金溶液进行反应，反应结束后用酶标仪记录终点状态检测值；所述中和抗体为病原微生物侵入人或动物体内时产生的具有相应的中和能力的抗体，所述病原微生物为传染病类病原微生物或病毒载体；所述受体蛋白是与病毒片段蛋白特异性结合的蛋白。2.根据权利要求1所述的基于NanoSPR生物芯片的检测人或动物体内中和抗体的方法，其特征在于，步骤S1具体为：取集成有NanoSPR生物芯片的芯片微孔板，在每个微孔的NanoSPR生物芯片上先用病毒片段蛋白或受体蛋白进行第一次孵育，孵育温度4
‑
37℃，孵育时间2
‑
24h；用缓冲液清洗并氮气吹干后，加入酪蛋白封闭液进行第二次孵育，孵育温度4
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37℃，孵育时间0.5
‑
2h；用缓冲液清洗并氮气吹干后，备用；将待测样本用稀释液梯度稀释后待用。3.根据权利要求1所述的基于NanoSPR生物芯片的检测人或动物体内中和抗体的方法，其特征在于，步骤S1中，稀释待测样本的稀释液是质量分数2％NaCl的PBST缓冲液。4.根据权利要求1所述的基于NanoSPR生物芯片的检测人或动物体内中和抗体的方法，其特征在于，步骤S2中，标记有受体蛋白或病毒片段蛋白的胶体金溶液的制备方法具体为：取1ml胶体金溶液，加入6
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20μL 0.1M碳酸钾溶液，混匀；然后加入1
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10μg受体蛋白或病毒片段蛋白混匀、静置；再加入5
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15μL10％的PEG 20000混匀，静置；冷冻离心，去上清后取沉淀加入100
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500μL复溶液混匀。5.根据权利要求4所述的基于NanoSPR生物芯片的检测人或动物体内中和抗体的方法，其特征在于，步骤S2中制备标记有受体蛋白或病毒片段蛋白的胶体金溶液时，冷冻离心的条件为2
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8℃、7000
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10000rpm离心20
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40min。6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄丽萍，李睿，周翰霖，刘钢，
申请(专利权)人：量准武汉生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：