一种尿液脱落细胞中膀胱癌细胞的标记方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种尿液脱落细胞中膀胱癌细胞的标记方法及检测试剂盒。该标记方法包括如下步骤：将尿液样本预处理为尿液脱落细胞悬液；提供细胞过滤器，细胞过滤器中设有捕获芯片，捕获芯片包括具有多个筛孔的网状基体及孵育至网状基体的表面上的捕获抗体，捕获抗体能够和肿瘤细胞特异性结合的捕获抗体；将尿液脱落细胞悬液通入细胞过滤器中，使其中的肿瘤细胞特异性结合至捕获芯片上；采用染色溶液对捕获芯片进行孵育，染色溶液包括标记有第一荧光物质的CK20抗体、标记有第二荧光物质的CD45抗体及细胞核染料，第一荧光物质、第二荧光物质和细胞核染料产生的荧光的颜色互不相同；根据荧光颜色标记出膀胱癌细胞。本发明专利技术具有较高的敏感性和特异性。敏感性和特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种尿液脱落细胞中膀胱癌细胞的标记方法及检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种尿液脱落细胞中膀胱癌细胞的标记方法及检测试剂盒。

技术介绍

[0002]膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一，在我国发病率居所有泌尿系统肿瘤首位。其中以尿路上皮癌(urothelium carcinoma,UC)最为常见。膀胱癌患者术后即使进行辅助治疗，术后1年复发率仍可达15％
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61％，术后5年复发率可达50％
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70％。因此，早期诊断和发现肿瘤对于膀胱癌的治疗和降低术后复发率十分重要。目前，膀胱癌诊断中常用的方法包括膀胱镜检查、影像学检查、荧光原位杂交(FISH)、一些尿液肿瘤标记物、尿脱落细胞学检查等。影像学检查对病灶较小的肿瘤敏感性低，存在一定的假阳性率。荧光原位杂交的敏感性优于尿脱落细胞学检查为0.79(95％CI 0.69
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0.75)，但是特异性低于尿脱落细胞学检查为0.83(95％CI 0.82
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0.85)，良性膀胱疾病的患者中常见假阳性结果，且荧光原位杂交的成本较高不利于技术普及。目前尿液肿瘤标记物的检测如NMP22 BladderChek和ImmunoCyt/uCyt等其敏感性分别为0.59(95％CI 0.39
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0.75)，0.73(95％CI 0.68
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0.77)；特异性分别为0.88(95％CI 0.78
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0.94)，0.66(95％CI 0.63
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0.69)。敏感性低于FISH，特异性低于尿脱落细胞学检查。目前尿液肿瘤标志物检测的敏感度高但特异性相对较低，尚未在临床上广泛应用。迄今为止，对膀胱癌患者，没有任何一种尿肿瘤标志物能够取代膀胱镜检查和尿细胞学检查。而尿脱落细胞学检查和膀胱镜检查是临床上诊断膀胱癌最可靠的方法。但是膀胱镜检查是一种创伤性检查有一定的痛苦性。尿脱落细胞学检查是对由泌尿系统中生长的肿瘤直接脱落的细胞即以尿脱落肿瘤细胞(Urinary
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exfoliated tumor cells,UETCs)用作尿细胞学的诊断标志物的检测，是一种无创检测，但是敏感性仅为0.37(95％CI 0.35
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0.39)，且易受到结石、炎症等因素的影响而出现假阳性结果。

技术实现思路

[0003]针对上述技术问题，本专利技术提供一种非诊断治疗目的的尿液脱落细胞中膀胱癌细胞的标记方法，其具有较高的敏感性和特异性。本专利技术还提供一种尿液脱落细胞中膀胱癌细胞的检测试剂盒，其具有较高的敏感性和特异性。
[0004]为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0005]一种尿液脱落细胞中膀胱癌细胞的标记方法，包括如下步骤：
[0006]将尿液样本预处理为尿液脱落细胞悬液；
[0007]提供细胞过滤器，所述细胞过滤器中设有捕获芯片，所述捕获芯片包括具有多个筛孔的网状基体及孵育至所述网状基体的表面上的捕获抗体，所述捕获抗体能够和肿瘤细胞特异性结合的捕获抗体；
[0008]将所述尿液脱落细胞悬液通入所述细胞过滤器中，使其中的肿瘤细胞特异性结合至所述捕获芯片上；
[0009]采用染色溶液对捕获芯片进行孵育，所述染色溶液包括标记有第一荧光物质的
CK20抗体、标记有第二荧光物质的CD45抗体及细胞核染料，所述第一荧光物质、所述第二荧光物质和所述细胞核染料产生的荧光的颜色互不相同；
[0010]根据荧光颜色标记出膀胱癌细胞。
[0011]优选地，所述捕获抗体选自EpCAM、CD44v6和Vimentin中的一种或多种的组合。更优选地，所述捕获抗体为EpCAM抗体。EpCAM是一种单通道的I型质膜糖蛋白，同型Ca2+非依赖性细胞粘附分子，在癌细胞中高表达促进癌细胞的增殖，对癌细胞发生和转移具有作用，用于特异性捕获上皮癌细胞。
[0012]优选地，所述细胞核染料包括DAPI。DAPI是一种可以穿透细胞膜的DNA染料，可发出蓝色荧光。
[0013]优选地，所述第一荧光物质及所述第二荧光物质独立地选自Alexa488、PE、FITC及APC，并且满足上述条件：所述第一荧光物质、所述第二荧光物质和所述细胞核染料产生的荧光的颜色互不相同。更优选地，所述第一荧光物质为Alexa488，所述第二荧光物质为PE。其中，Alexa488为亮绿色荧光染料，具有水溶性和较强的pH稳定性(pH4
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10)，可被488nm激光激发产生信号稳定的绿色荧光；PE，全称为藻红蛋白(P
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phycoerythrin)，是从红藻中分离纯化获得的一种常见染料，经激光激发后发出橙黄色荧光，最大发射波长为575nm；FITC，全称为异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate)，最大激发波长为494nm，一旦激发在最大发射波长520nm处呈黄
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绿色荧光；APC，全称为别藻蓝蛋白(Allophycocyanin)，是从蓝绿藻中分离纯化的藻胆蛋白，被激光激发后发出红色荧光。
[0014]优选地，所述筛孔的孔径为8～200μm。此处，筛孔为圆形时，孔径是指该圆形的直径；筛孔为多边形时，孔径是指该多边形的最短边长。在一具体且优选的实施例中，筛孔为正方形，筛孔的孔径是指该正方形的边长。
[0015]更优选地，所述筛孔的孔径为8～100μm。进一步地，所述筛孔的孔径为8～40μm。更进一步地，所述筛孔的孔径为8～20μm。可选地，筛孔的孔径为8μm、10μm、13μm、15μm、18μm或20μm。
[0016]优选地，将尿液样本预处理为尿液脱落细胞悬液的步骤包括：采用预过滤器对尿液样本进行预过滤，该预过滤器的滤孔的孔径不小于40μm；预过滤后的滤液置于离心管中，离心，弃上清液，清洗沉淀后用缓冲液将沉淀重悬为尿液脱落细胞悬液。
[0017]优选地，所述细胞过滤器还包括具有腔室的壳体，所述壳体上设有与所述腔室连通的连接口和液流口，所述捕获芯片水平或倾斜地设置于所述腔室中，所述连接口位于所述捕获芯片的上侧，所述液流口位于所述捕获芯片的下侧；将所述连接口连接到移液器上，液流口插入所述尿液脱落细胞悬液或所述染色溶液中，移液器向所述腔室提供负压将所述尿液脱落细胞悬液或所述染色溶液吸入所述腔室内，使所述尿液脱落细胞悬液或所述染色溶液和所述捕获芯片接触反应，之后移液器向所述腔室提供正压将残液自所述液流口排出。
[0018]在一具体且优选的实施例中，所述捕获抗体为EpCAM抗体，所述细胞过滤器还包括具有腔室的壳体，所述壳体上设有与所述腔室连通的连接口和液流口，所述捕获芯片水平或倾斜地设置于所述腔室中，所述连接口位于所述捕获芯片的上侧，所述液流口位于所述捕获芯片的下侧；
[0019]所述标记方法具体实施如下：
[0020]采用预过滤器对尿液样本进行预过滤，该预过滤器的滤孔的孔径不小于40μm；预过滤后的滤液置于离心管中，离心，弃上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种尿液脱落细胞中膀胱癌细胞的标记方法，其特征在于，包括如下步骤：将尿液样本预处理为尿液脱落细胞悬液；提供细胞过滤器，所述细胞过滤器中设有捕获芯片，所述捕获芯片包括具有多个筛孔的网状基体及孵育至所述网状基体的表面上的捕获抗体，所述捕获抗体能够和肿瘤细胞特异性结合的捕获抗体；将所述尿液脱落细胞悬液通入所述细胞过滤器中，使其中的肿瘤细胞特异性结合至所述捕获芯片上；采用染色溶液对捕获芯片进行孵育，所述染色溶液包括标记有第一荧光物质的CK20抗体、标记有第二荧光物质的CD45抗体及细胞核染料，所述第一荧光物质、所述第二荧光物质和所述细胞核染料产生的荧光的颜色互不相同；根据荧光颜色标记出膀胱癌细胞。2.根据权利要求1所述的标记方法，其特征在于，所述捕获抗体选自EpCAM、CD44v6和Vimentin中的一种或多种的组合。3.根据权利要求1所述的标记方法，其特征在于，所述第一荧光物质及所述第二荧光物质独立地选自Alexa 488、PE、FITC及APC。4.根据权利要求3所述的标记方法，其特征在于，所述第一荧光物质为Alexa 488，所述第二荧光物质为PE，所述细胞核染料包括DAPI。5.根据权利要求1所述的标记方法，其特征在于，所述筛孔的孔径为8～200μm。6.根据权利要求5所述的标记方法，其特征在于，所述筛孔的孔径为8～20μm。7.根据权利要求1所述的标记方法，其特征在于，将尿液样本预处理为尿液脱落细胞悬液的步骤包括：采用预过滤器对尿液样本进行预过滤，该预过滤器的滤孔的孔径不小于40μm；预过滤后的滤液置于离心管中，离心，弃上清液，清洗沉淀后用缓冲液将沉淀重悬为尿液脱落细胞悬液。8.根据权利要求1所述的标记方法，其特征在于，所述细胞过滤器还包括具有腔室的壳体，所述壳体上设有与所述腔室连通的连接口和液流口，所述捕获芯片水平或倾斜地设置于所述腔室中，所述连接口位于所述捕获芯片的上侧，所述液流口位于所述捕获芯片的下侧；将所述连接口连接到移液器上，液流口插入所述尿液脱落细胞悬液或所述染色溶液中，移液器向所述腔室提供负压将所述尿液脱落细胞悬液或所述染色溶液吸入所述腔室内，使所述尿液脱落细胞悬液或所述染色溶液和所述捕获芯片接触反应，之后移液器向所述腔室提供...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜菁，朱燕楠，
申请(专利权)人：江苏汇先医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：