本发明专利技术公开了一种糖基化磁性类细胞识别受体的制备方法。属于生物医学传感技术和医学检验技术领域。包括以下步骤：细胞膜修饰叠氮基；细胞膜提取；细胞膜包被Fe3O4纳米粒子；二苯并环辛炔胺修饰肝素的合成；糖基化磁性类细胞识别受体的制备与电极修饰。本发明专利技术采用Fe3O4纳米粒子作为类细胞识别受体的内核；以聚糖修饰的细胞膜为类细胞识别受体的壳层；将其与电化学检测结合，可以极大提高检测灵敏度，缩短检测时间；随着目标抗原浓度的升高，糖基化磁性类细胞识别受体作为电化学传感器的识别元件通过表面的ACE2和肝素对不同浓度的新冠病毒S蛋白抗原进行特异性捕获，可以获得良好的检测性能，操作简单，成本较低。成本较低。成本较低。
【技术实现步骤摘要】
一种糖基化磁性类细胞识别受体的制备方法
[0001]本专利技术涉及生物医学传感技术和医学检验
，更具体的说是涉及一种糖基化磁性类细胞识别受体的制备方法。
技术介绍
[0002]抗原检测作为一种可靠性高，便捷易用且成本较低的方法，用于检测多种生物样品中特定抗原。这种基于配体和受体特异性结合的检测方法已广泛应用于生化研究、临床诊断等领域。
[0003]目前，检测新型冠状病毒(SARS
‑
Cov
‑
2)及其变异株的主要方法为PCR法。该方法具有耗时较长，专业技能要求较高等弊端。在众多的检测方法中，生物传感器具有快速、灵敏并准确的优点。电化学生物传感器检测具有灵敏度高、操作简单、易于微型化和批量化加工的优点，可以应用于蛋白质、病毒和细菌等的检测。
[0004]但是，目前筛选优异的选择性识别受体，通过化学或物理方法构建传感界面是发展电学生物传感器的关键技术瓶颈问题。针对SARS
‑
Cov
‑
2病毒检测鉴别的大部分的生物传感器均需依赖抗体为识别受体，这类生物传感器称为免疫生物传感器。
[0005]研究表明，S蛋白和宿主受体ACE2均具有高水平糖基化的特征。聚糖直接参与和调节病毒对宿主细胞的选择性结合、粘附、侵入以及免疫应答。
[0006]因此，能否提供一种新型识别受体，即基于糖基化磁性类细胞识别受体(glycosylated and magnetic cell
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like recognition receptors，GMCR)，用于电化学传感器构建和SARS
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Cov
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2快速超灵敏检测是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
[0007]有鉴于此，本专利技术提供了一种糖基化磁性类细胞识别受体的制备方法。构建基于聚糖和ACE2受体双重识别的电化学生物传感器，可以更加特异灵敏度地检测SARS
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Cov
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2病毒抗原。为SARS
‑
Cov
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2的快速检测提供了新的策略，为其诊断和监测提供新的可能。
[0008]该识别受体可选择性捕获新冠病毒表面刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)或其病毒颗粒。利用糖基化过表达ACE2的细胞膜作为壳层，利用Fe3O4纳米粒子核层，构建细胞膜包裹的Fe3O4纳米粒子。将多糖—肝素修饰在细胞膜表面，构建了肝素和AEC2的复合传感界面，用于选择性识别和捕获新冠病毒。由于Fe3O4纳米粒子可稳定、大量吸附于磁性电极表面，所以该电化学传感器的构建非常简单，且可通过磁铁的吸引或释放，使得电极可以重复利用。由于肝素和ACE2的双重识别，该识别受体捕获新冠病毒S蛋白或病毒颗粒的效率非常高。此方法的建立可为新冠病毒及其它多种病毒相关疾病的高灵敏度电化学抗原分析奠定基础。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0010]一种糖基化磁性类细胞识别受体的制备方法，包括以下步骤：
[0011](1)细胞膜修饰叠氮基；
[0012](2)细胞膜提取；
[0013](3)细胞膜包被Fe3O4纳米粒子；
[0014](4)二苯并环辛炔胺修饰肝素的合成；
[0015](5)糖基化磁性类细胞识别受体的制备。
[0016]优选的：步骤(1)包括：将上皮细胞用含胎牛血清和青霉素
‑
链霉素的DMEM培养液培养；细胞保持在二氧化碳环境中；接种后，加入N
‑
叠氮基乙酰甘露糖胺
‑
四酰化，培养，离心收集细胞，洗涤得到叠氮基修饰的细胞。
[0017]进一步的，上皮细胞包括：人肾上皮细胞HEK
‑
293T细胞系、肠上皮细胞、口腔上皮细胞，即过表达ACE2的所有细胞系均可；更进一步的购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司41107ES03HEK
‑
293T
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ACE2过表达细胞株；
[0018]接种：接种于10cm细胞培养板中。
[0019]优选的：步骤(2)包括：将步骤(1)得到的叠氮基修饰的细胞重新悬浮在低渗裂解缓冲液中，然后对细胞破碎处理，取匀浆溶液离心，收集细胞膜，清洗得到叠氮基修饰的细胞膜，通过BCA法对膜蛋白质量进行定量。
[0020]优选的：步骤(3)包括：将叠氮基修饰的细胞膜与Fe3O4纳米粒子混合，然后超声处理，使用脂质体挤出器挤压，得到叠氮基修饰的细胞膜包被的纳米粒子。
[0021]优选的：步骤(4)包括：将肝素钠盐溶解在4
‑
吗啉乙磺酸缓冲液中，加入1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N
‑
羟基琥珀酰亚胺处理，得溶液；然后将DBCO
‑
NH2加入二甲基亚砜中，搅拌后滴加到所述溶液中；反应后，得二苯并环辛炔胺修饰肝素，透析纯化。
[0022]有益效果在于：使得肝素表面羧基得以活化。
[0023]优选的：步骤(5)包括：将叠氮基修饰的细胞膜包被的纳米粒子加入含二苯并环辛炔胺修饰肝素中，溶剂为1
×
PBS，得混合物，振荡反应后，离心，收集即得糖基化磁性类细胞识别受体。
[0024]有益效果在于：通过无铜点击化学反应将二苯并环辛炔胺修饰肝素(DBCO
‑
肝素)缀合到叠氮基修饰的细胞膜包被的磁性纳米粒子上来制备糖基化磁性类细胞识别受体(GMCR)。
[0025]优选的：步骤(1)所述胎牛血清含量为10％；青霉素
‑
链霉素含量为1％；所述二氧化碳环境：37℃，浓度为5％；所述N
‑
叠氮基乙酰甘露糖胺
‑
四酰化终浓度50μM；接种的上皮细胞、DMEM培养液的体积比为1：20；所述培养时间：72h；所述离心：800
×
g；所述洗涤：pH＝7.41
×
PBS洗涤3次；
[0026]步骤(2)所述低渗裂解缓冲液pH＝7.5，含有30mM Tris
‑
HCl、225mM D
‑
甘露醇、75mM蔗糖、0.2mM乙二醇双(β
‑
氨基乙基醚)
‑
N，N，N
‘
，N
’‑
四乙酸乙二醇酯、蛋白酶和磷酸酶抑制剂；破碎处理：使用探头式超声破碎仪，功率25％～30％，直至溶液清亮；离心：4℃、20k
×
g条件下离心25min，取上清液在100k
×
g、4℃条件下离心35min；所述清洗：用0.2mM乙二胺四乙酸水洗2次；
[0027]步骤(3)所述Fe3O4纳米粒子与叠氮基修饰的细胞膜中的膜蛋白的质量比为1：1；超声处理：频率20％～30％，时间为2～3min；挤压次数为20本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种糖基化磁性类细胞识别受体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)细胞膜修饰叠氮基；(2)细胞膜提取；(3)细胞膜包被Fe3O4纳米粒子；(4)二苯并环辛炔胺修饰肝素的合成；(5)糖基化磁性类细胞识别受体的制备。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括：将上皮细胞用含胎牛血清和青霉素
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链霉素的DMEM培养液培养；细胞保持在二氧化碳环境中；接种后，加入N
‑
叠氮基乙酰甘露糖胺
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四酰化，培养，离心收集细胞，洗涤得到叠氮基修饰的细胞。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括：将步骤(1)得到的叠氮基修饰的细胞重新悬浮在低渗裂解缓冲液中，然后对细胞破碎处理，取匀浆溶液离心，收集细胞膜，清洗得到叠氮基修饰的细胞膜，通过BCA法对膜蛋白质量进行定量。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)包括：将叠氮基修饰的细胞膜与Fe3O4纳米粒子混合，然后超声处理，使用脂质体挤出器挤压，得到叠氮基修饰的细胞膜包被的纳米粒子。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)包括：将肝素钠盐溶解在4
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吗啉乙磺酸缓冲液中，加入1
‑
乙基
‑3‑
(3
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二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N
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羟基琥珀酰亚胺处理，得溶液；然后将DBCO
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NH2加入二甲基亚砜中，搅拌后滴加到所述溶液中；反应后，得二苯并环辛炔胺修饰肝素，透析纯化。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)包括：将叠氮基修饰的细胞膜包被的纳米粒子加入含二苯并环辛炔胺修饰肝素中，溶剂为1
×
PBS，得混合物，振荡反应后，离心，收集即得糖基化磁性类细胞识别受体。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述胎牛血清含量为10％；青霉素
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链霉素含量为1％；所述二氧化碳环境：37℃，浓度为5％；所述N
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叠氮基乙酰甘露糖胺
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四酰化终浓度50μM；接种的上皮细胞、DMEM培养液的体积比为1：20；所述培养时间：72h；所述离心：800
×
g；所述洗涤：pH＝7.41
×
PBS洗涤3次；步骤(2)所述低...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾赤佳，周钦，崔飞云，刘建雷，庄锡伟，
申请(专利权)人：佛山禅迪精准医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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