用于常规PCR扩增的免提取型核酸释放剂制造技术

本发明专利技术公开了一种用于常规PCR扩增的免提取型核酸释放剂，涉及PCR扩增技术领域，其原料配方为TritonX

【技术实现步骤摘要】
用于常规PCR扩增的免提取型核酸释放剂


[0001]本专利技术涉及PCR扩增
，特别涉及用于常规PCR扩增的免提取型核酸释放剂。

技术介绍

[0002]PCR扩增是是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，能将微量的DNA大幅增加。PCR由变性
‑
退火
‑
延伸三个基本反应步骤构成：首先将模板DNA加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离成为单链，以便与引物结合；然后温度降至55℃左右进行退火，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；随后，DNA模板
‑
引物结合物在72℃、耐热DNA聚合酶(例如TaqDNA聚合酶)的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链；上述一个循环需2
‑
4min，重复循环上述变性
‑
退火
‑
延伸过程，每循环2
‑
3h就能将目的基因扩增放大几百万倍。随后再将经过PCR放大后的产物进行检测。
[0003]在进行PCR扩增之前，需要获得待扩增的目的基因或DNA模板，常用方法是将生物样本细胞裂解，使目的基因或DNA模板释放出来。现有关于核酸释放或者核酸提取主要采用碱裂解法、浓盐法、苯酚抽提法、水抽提法、阴离子去污剂法、硅胶膜法和磁珠法等。这些方法提取核酸耗时长，很多情况下都需要使用专业试剂盒，并按照试剂盒说明书要求一步步操作，耗时很长，对操作人员专业技术水平和仪器的要求较高。此外在核酸提取时必须在超净工作台上进行，否则容易产生污染，或者提取浓度不达标。针对这一现状，如何实现恒温、快速、简便的一步法提取核酸技术，具有可观的发展前景。

技术实现思路

[0004]针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了一种用于常规PCR扩增的免提取型核酸释放剂，具体通过以下技术实现。
[0005]一种免提取型核酸释放剂，其特征在于，其原料配方为TritonX
‑
100 1
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5wt％、DTT 10
‑
15mM、EDTA 1
‑
4.5mM、Tris
‑
HCl 10
‑
50mM、NaOH 50
‑
150mM和水。
[0006]本专利技术提供的核酸释放剂中，NaOH提供了一个碱性环境，使细胞膜更容易破裂，释放核酸。细胞在裂解的过程中，非离子型表面活性剂TritonX
‑
100一方面可以加速细胞外膜蛋白和脂类的溶解，加快核酸释放，另一方面可以很好的对核酸特别是单链的RNA起到保护作用，使RNA能够在碱性环境中得以保存；金属离子螯合剂EDTA可以结合溶液中的金属离子，从而抑制RNA酶活性，阻止核酸降解；Tris
‑
HCl为缓冲液，调节体系稳定；DTT为还原剂可以打断二硫键，使染色体DNA结合的蛋白质从DNA上释放出来，破坏蛋白质的稳定活性。本专利技术提供的核酸释放剂，只需要进行简单的混合、孵育，即可直接进行常规PCR扩增；而不需要任何提纯、离心等多余步骤，有效节省了时间。
[0007]优选地，本专利技术提供的核酸释放剂的原料配方为TritonX
‑
100 1wt％、DTT12.5mM、
EDTA 2mM、Tris
‑
HCl 10mM、NaOH 100mM和水。
[0008]优选地，本专利技术提供的核酸释放剂的原料配方还含有0.001wt％的提取指示剂，所述提取指示剂为溴酚蓝、石绿、甲基红、甲基橙、罗丹明、溴甲酚绿、品红、二甲酚橙、二苯胺或刚果红中的一种。
[0009]本专利技术提供了一种细胞样品的核酸提取试剂盒，含有上述任一项所述的免提取型核酸释放剂。
[0010]本专利技术还提供了一种细胞样品的核酸提取方法，其步骤为：在细胞样本(位于离心管中)中加入上述免提取型核酸释放剂，涡旋振荡均匀；然后室温孵育，孵育期间定期(颠倒)混匀一次；孵育结束后，可以直接进行后续PCR扩增。
[0011]优选地，上述核酸提取方法中，加入的所述细胞样本的体积为1
‑
200μL，且所述样本和免提取型核酸释放剂的体积比为(0.5
‑
2):1。
[0012]优选地，上述核酸提取方法中，涡旋振荡的转速为1000
‑
3000rpm，时间为15
‑
30s。
[0013]优选地，上述核酸提取方法中，室温孵育的时间为10
‑
15min，孵育期间每隔3
‑
5min颠倒混匀一次。
[0014]与现有技术相比，本专利技术的有益之处在于：本专利技术提供的核酸释放剂，在于样品混合、孵育后，即可直接放入PCR扩增仪中进行PCR处理。相比于目前常见的核酸释放剂而言，省略了提纯、离心等步骤，经过直接PCR扩增后的目的核酸产物电泳条带单一、清晰。
附图说明
[0015]图1为实施例1
‑
3制备的核酸释放剂在裂解后的电泳图；
[0016]图2为对比例1
‑
4制备的核酸释放剂在裂解后和多比例稀释的裂解混合液的电泳图。
具体实施方式
[0017]下面将对本专利技术的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0018]以下实施例和对比例所提供的免提取型核酸释放剂，其所有原料试剂来源为：1139
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100mL TritonX
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100和1340
‑
500g EDTA采购于BioFROXX，M10913701NaOH采购于国药集团，D806827
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5gDTT和T917654
‑
100mL Tris
‑
HCl采购于麦克林公司，P111
‑
01 2
×
Taq Master MIX采购于Vazyme。
[0019]实施例1
[0020]本实施例提供的免提取型核酸释放剂，其原料和最终浓度为TritonX
‑
1001wt％、DTT 12.5mM、EDTA 2mM、Tris
‑
HCl 10mM、NaOH 100mM和超纯水，pH值为7.33。
[0021]实施例2
[0022]本实施例提供的免提取型核酸释放剂，其原料为TritonX
‑
100 1.5wt％、DTT15mM、EDTA 1mM、Tris
‑
HCl 50mM、NaOH 150mM和超纯水，pH值为7.50。
[0023]实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种免提取型核酸释放剂，其特征在于，其原料配方为TritonX
‑
100 1
‑
5wt％、DTT 10
‑
15mM、EDTA 1
‑
4.5mM、Tris
‑
HCl 10
‑
50mM、NaOH 50
‑
150mM和水。2.根据权利要求1所述的免提取型核酸释放剂，其特征在于，其原料配方为TritonX
‑
100 1wt％、DTT 12.5mM、EDTA 2mM、Tris
‑
HCl 10mM、NaOH 100mM和水。3.根据权利要求1所述的免提取型核酸释放剂，其特征在于，其原料配方还含有0.001wt％的提取指示剂，所述提取指示剂为溴酚蓝、石绿、甲基红、甲基橙、罗丹明、溴甲酚绿、品红、二甲酚橙、二苯胺或刚果红中的一种。4.一种细胞样品的核酸提...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄丽萍，何佳俊，陈友倩，刘钢，
申请(专利权)人：量准武汉生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：