一种高效提取外泌体microRNA的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种高效提取外泌体microRNA的方法及试剂盒，属于生物技术领域。本发明专利技术提供的提取外泌体microRNA的方法包括使用含有异硫氰酸胍和多种去垢剂的裂解液来裂解外泌体，促进microRNA与结合蛋白的解离，释放microRNA，随后利用DNA纯化柱清除裂解液中的蛋白质和DNA，并使用羟基修饰的磁珠来吸附microRNA，洗脱液洗脱后可以获得去除DNA和蛋白质的高纯度microRNA，能够用于测序、建库及RT

【技术实现步骤摘要】
一种高效提取外泌体microRNA的方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种高效提取外泌体microRNA的方法及试剂盒，尤其涉及一种高效提取高纯度外泌体microRNA的方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]外泌体是细胞分泌的一系列直径为30
‑
150nm的小囊泡，富含蛋白质、DNA、mRNA以及microRNA等生物分子，广泛分布于血液、乳液、唾液、尿液等体液中，并随着体液的流动而运动，是细胞间物质转运和信号转导的重要载体。正常细胞与病变细胞(例如肿瘤、慢性炎症及自身免疫性疾病等引起)分泌的外泌体在成分组成上存在很大差异，尤其是microRNA，其水平变化与肿瘤、慢性炎症及自身免疫性疾病的发生与发展密切相关，因此针对外泌体中microRNA的提取和检测对这些疾病的诊断、治疗和预后评估均具有重要意义。另外，microRNA也称微小核糖核酸，是由19
‑
25个碱基组成的非编码单链RNA，其作为外泌体的重要成分，可以通过调控基因的表达来发挥重要的生物学功能，在肿瘤等疾病的发展过程中具有重要调控作用，因此针对外泌体中microRNA的提取对于其调控基因的表达机理研究等也具有重要的意义。
[0003]目前市场上常采用提取RNA的方法来提取microRNA，其主要是通过TRIzol溶液裂解细胞/组织，再通过氯仿对溶液进行分层去除蛋白质和DNA，并使RNA分布在上层的有机相中，在该有机相中添加异丙醇，离心后可以沉淀RNA，完成RNA的提取。但对于此种方法，当样品量较少，或样品中的RNA含量较少时，离心后的RNA沉淀会很少，几乎观察不到，无法有效提取RNA，因此该方法并不适用于提取作为微量样品、且其中microRNA含量很低的外泌体中的microRNA。为了促进RNA的沉淀，常用糖原或tRNA作为助沉剂(例如专利文献CN106318931A)，然而效果并不明显，且会导致提取的RNA纯度下降，不利于后续的测序、建库等分子生物学实验。市售的TRIzol
TM plus纯化试剂盒将TRIzol试剂与RNA纯化柱结合，其利用RNA纯化柱作为载体，来吸附微量的RNA，但对microRNA的提取效果不理想，主要原因是microRNA常与蛋白结合，不能够有效结合RNA纯化柱，进而不利于microRNA的提取。
[0004]为了促进microRNA的提取，专利文献CN111004798A(以下称文献1)公开一种高效提取microRNA的方法，其通过胍盐裂解样品，并利用金属阳离子和水混溶性醇同时沉淀蛋白和长链核酸，随后用硅基质膜吸附柱吸附microRNA，同时利用低浓度胍盐和高浓度乙醇洗去杂质，可以大幅度提高microRNA的提取效率，然而在该文献1提供的microRNA分离步骤中，大量异丙醇的添加会导致纯化系统体积明显增大，使用RNA纯化柱(每次过柱液体的体积较小，一般为0.5
‑
0.7ml)提取时，需要多次过柱，才能完成样品中microRNA的吸附，效率较低且操作繁琐，并且完成microRNA的吸附后，需要进行多次漂洗，会导致microRNA的流失。此外，使用裂解液裂解样品后，DNA也会随着microRNA一起释放到样品溶液中，添加异丙醇或无水乙醇后，都会吸附到RNA纯化柱上，并随着microRNA一起洗脱下来，因此会导致microRNA纯度降低。虽然在专利文献CN108949747A(以下称文献2)提供的方法中可使用DNase I降解DNA，但该方法的过程较为繁琐，会显著降低实验的可操作性。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的一个或多个问题，本专利技术的一个方面提供一种高效提取外泌体microRNA的方法，其包括以下步骤：
[0006]S1)使用裂解液裂解外泌体，得到第一混合液；
[0007]S2)将步骤S1)所得第一混合液转移至DNA纯化柱内，离心，得到滤液；
[0008]S3)向步骤S2)所得滤液中加入醇类，混匀，得到第二混合液；
[0009]S4)向步骤S3)所得第二混合液中加入表面修饰有羟基的磁珠，并孵育，得到吸附有microRNA的磁珠，富集所述吸附有microRNA的磁珠，得到第一磁珠；
[0010]S5)向步骤S4)所得第一磁珠中加入去蛋白液，洗涤第一磁珠，得到第二磁珠；
[0011]S6)向步骤S5)所得第二磁珠中加入洗涤液，洗涤第二磁珠，得到第三磁珠；和
[0012]S7)向步骤S6)所得第三磁珠中加入洗脱液，洗脱得到外泌体的microRNA。
[0013]在一些实施方式中，步骤S1)中所述外泌体来源于细胞培养上清、血清、血浆或其他生物样品。
[0014]在一些实施方式中，步骤S1)中所述裂解液包含2
‑
5M，优选3
‑
4M的异硫氰酸胍溶液和体积百分比为1
‑
5％的去垢剂，其中所述去垢剂为选自Triton X
‑
100、Tween
‑
20、NP
‑
40、SDS、CHAPS和脱氧胆酸钠中的多种。
[0015]在一些实施方式中，步骤S1)中所述裂解液与外泌体样品的混合体积比为(2
‑
4)：1。
[0016]在一些实施方式中，步骤S3)中所述醇类选自异丙醇、乙醇中的一种或多种。
[0017]在一些实施方式中，步骤S3)中所述醇类的加入量为使其终浓度为50％以上。
[0018]在一些实施方式中，步骤S4)中所述孵育的条件为：2
‑
8℃条件下旋转孵育30min以上。
[0019]在一些实施方式中，步骤S4)中富集所述吸附有microRNA的磁珠的操作包括：将含有所述吸附有microRNA的磁珠的离心管置于磁力架上，使磁珠聚集，或将含有所述吸附有microRNA的磁珠的离心管置于离心机中离心，使磁珠沉淀。
[0020]在一些实施方式中，步骤S5)中所述去蛋白液包含1
‑
3M，优选1.5
‑
2M的异硫氰酸胍和70％乙醇。
[0021]在一些实施方式中，步骤S6)中所述洗涤液包含10
‑
30mM Tris
‑
Hcl，pH范围是6.5
‑
8.0。
[0022]在一些实施方式中，步骤S7)中所述洗脱液包含10mM柠檬酸钠和10mM EDTA.Na2，pH范围是7.5
‑
8.0。
[0023]本专利技术另一方面提供一种高效提取外泌体microRNA的试剂盒，其包括：
[0024](1)裂解液，其包含2
‑
5M，优选3
‑
4M的异硫氰酸胍溶液和体积百分比为1
‑
5％的去垢剂，其中所述去垢剂为选自Triton X
‑
100、Tween
‑
20、NP
‑
40、S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效提取外泌体microRNA的方法，其包括以下步骤：S1)使用裂解液裂解外泌体，得到第一混合液；S2)将步骤S1)所得第一混合液转移至DNA纯化柱内，离心，得到滤液；S3)向步骤S2)所得滤液中加入醇类，混匀，得到第二混合液；S4)向步骤S3)所得第二混合液中加入表面修饰有羟基的磁珠，并孵育，得到吸附有microRNA的磁珠，富集所述吸附有microRNA的磁珠，得到第一磁珠；S5)向步骤S4)所得第一磁珠中加入去蛋白液，洗涤第一磁珠，得到第二磁珠；S6)向步骤S5)所得第二磁珠中加入洗涤液，洗涤第二磁珠，得到第三磁珠；和S7)向步骤S6)所得第三磁珠中加入洗脱液，洗脱得到外泌体的microRNA。2.根据权利要求1所述的方法，步骤S1)中所述外泌体来源于细胞培养上清、血清、血浆或其他生物样品。3.根据权利要求1或2所述的方法，步骤S1)中所述裂解液包含2
‑
5M，优选3
‑
4M的异硫氰酸胍溶液和体积百分比为1
‑
5％的去垢剂，其中所述去垢剂为选自Triton X
‑
100、Tween
‑
20、NP
‑
40、SDS、CHAPS和脱氧胆酸钠中的多种。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，步骤S1)中所述裂解液与外泌体样品的混合体积比为(2
‑
4)：1。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，步骤S3)中所述醇类选自异丙醇、乙醇中的一种或多种；和/或步骤S3)中所述醇类的加入量为使其终浓度为50％以上。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，步骤S4)中所述孵育的条件为：2
‑
8℃条件下旋转孵育30min以上；和/或步骤S4)中富集所述吸附有microRNA的磁珠的操作包括：将含...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国柱，张益国，张美美，王丽丽，王晓鑫，
申请(专利权)人：北京奥秘佳得医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：