定向二硫键多元环肽库构建及配体筛选方法技术

定向二硫键多元环肽库构建及配体筛选方法，涉及噬菌体展示。可产生系列具有二硫键定向配对特性的多元环肽库。构建的噬菌体多元环肽库应用于对靶标蛋白HER2、HER3、FGFR1、EPHA2等筛选，获得能特异性与靶标蛋白结合的多元环肽配体。CPXXC基序有基序间定向二硫键配对性质，调控多肽氧化折叠路径，减少氧化异构体形成，促进多肽高效折叠至特定氧化产物。通过在随机多肽序列引入一对CPXXC基序和额外的半胱氨酸，多肽即被高效氧化成具有特定二硫键配对方式的多元环构型。通过调控半胱氨酸和脯氨酸的排列或图案，即可构建具有极大序列随机化程度的多元环肽库，可从更广阔的随机序列空间中筛选获得多元环肽配体和药物。筛选获得多元环肽配体和药物。

【技术实现步骤摘要】
定向二硫键多元环肽库构建及配体筛选方法


[0001]本专利技术涉及噬菌体展示，尤其是涉及一种定向二硫键多元环肽库构建及配体筛选方法。

技术介绍

[0002]环肽以高亲和力和高靶标特异性与蛋白靶点结合，是开发治疗药物的一个有吸引力的分子种类。环肽环状结构与线性肽相比构象受限，与目标物结合时熵损失更小，结合亲和力更高。多肽结构灵活性降低也稳定环肽的特定结构，增加与靶标结合的特异性。已有一系列环肽药物成功上市应用，如抗细菌的万古霉素、免疫抑制药物环孢素和抗肿瘤药物克雷奥肽等。
[0003]二硫键作为一种重要的翻译后修饰，经过数百万年，生物体内进化出一系列具有多种特定活性功能的富含二硫键环肽。因为良好生物活性，用于开发药物，比如目前上市的环肽药物Linaclotide，由14个氨基酸组成，分子内含有三对二硫键构成三元环肽，用于治疗成人的便秘性肠易激综合征(IBS
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C)和慢性特发性便秘(CIC)。还有一系列对这些天然环肽的改造以产生新的生物活性分子，比如环嫁接、序列随机化和生物筛选工作等。基于环肽展示的生物筛选平台是从序列多样的环肽文库中发现靶标配体。但富含二硫键的环肽自身存在一个很严重的二硫键重排和错配问题，基于这些天然环肽构建的文库需要保留大部分的序列以维持环肽骨架结构用以生成正确的二硫键，限制文库的序列多样性。同时富含多对二硫键的环肽支架的复杂性，一些不支持正确二硫键形成的序列不会得到展示，降低环肽在这些展示系统中的展示效率。为解决这个问题，需要解决二硫键配对的化学问题，使二硫键的连接方式不受到一级序列的调控，才可以实现在更多样的展示序列中获得性能更加优异的环肽分子。
[0004]噬菌体展示技术是由G.P.Smith于1985年首次提出的一种组合生物学技术，由于环肽分子的众多优异性能，噬菌体展示环肽文库也得到广泛的发展和应用。第一个噬菌体展示环肽文库由O
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Neil等人(O'Neil,K.T.,Hoess,R.H.,Jackson,S.A.,Ramachandran,N.S.,Mousa,S.A.,&DeGrado,W.F.(1992).Identification of novel peptide antagonists for GPIIb/IIIa from a conformationally constrained phage peptide library.Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,14(4),509
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515.)于1992年成功构建，融合展示出的多肽模型为CX6C，两侧的半胱氨酸氧化后生成一对二硫键将多肽环化，并成功利用该环肽文库筛选出特异性和血小板糖蛋白IIb/IIa结合的环肽配体。1993年McLafferty等人(McLafferty,M.A.,Kent,R.B.,Ladner,R.C.,&Markland,W.(1993).M13bacteriophage displaying disulfide
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constrained microproteins.Gene,128(1),29
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36.)构建一个展示多肽模型为XCX4CX的噬菌体环肽文库，在两个C的两侧各加一个随机氨基酸，分别对链霉亲和素和抗β
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内啡肽单抗进行筛选，并获得和它们特异性结合的单环肽配体，通过活性测试发现具有二硫键的环肽的亲和力明显高于还原肽。更多的利用此二硫键环化库针对更多的蛋白靶标进行筛选的工作，催生商用CX9C形式的噬菌体环
肽库的出现。与分子量相当的单环肽相比，双环肽和多环肽具有更高的结构刚性，从而赋予它们更高的与靶标结合亲和力和抗酶解稳定性。2009年，Christian Heinis等人(Heinis,C.,Rutherford,T.,Freund,S.,&Winter,G.(2009).Phage
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encoded combinatorial chemical libraries based on bicyclic peptides.Nature chemical biology,5(7),502
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507.)通过小分子修饰的方法成功构建二元环肽库，该噬菌体展示文库的多肽含有三个半胱氨酸(CX6CX6C)，将具有三个硫醇反应基团的小分子(1，3，5—三溴甲基苯)与多肽中的三个半胱氨酸反应，将展示于噬菌体表明的线性肽转化为二元环肽。针对靶标蛋白人血浆激肽释放酶筛选得到的环肽抑制剂，表现出Ki值为1.5nM的高亲和力。为生成结构更多样化的环肽文库，Christian Heinis课题组尝试更多的优化工作，包括改变两个环内的随机氨基酸个数和连接三个半胱氨酸的小分子种类。2012年，Shiyu Chen(Chen,S.,Morales
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Sanfrutos,J.,Angelini,A.,Cutting,B.,&Heinis,C.(2012).)等人利用四种不同的小分子对噬菌体展示的多肽进行环化后，发现针对同一个靶标筛选得到的多肽具有完全不同的共识序列，并且将多肽中的小分子交换后，发现该环肽的活性大幅降低甚至完全丧失。这些结果表明，更大的文库多样性对于筛选工作会提供更大的可能性和更多的选择性。但是与天然的二硫键相比，利用小分子进行后修饰的方法可能会对噬菌体造成一定的毒性，且也可能会影响噬菌体对宿主细胞的侵染能力，同时小分子的修饰效率也是一个需要优化的问题。但是对于含有多对二硫键的环肽来说，最大的致命问题是二硫键的配对问题，这影响环肽文库的展示效率。为解决这个问题，Chuanliu Wu课题组开展一系列的相关工作，2020年Shuaimin Lu(Lu,S.,Wu,Y.,Li,J.,Meng,X.,Hu,C.,Zhao,Y.,&Wu,C.(2020).Directed disulfide pairing and folding of peptides for the de novo development of multicyclic peptide libraries.Journal of the American Chemical Society,142(38),16285
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16291.)提出CPPC基序具有正交平行二聚性质的概念，并将此基序引入到噬菌体展示多肽中，成功有效调控噬菌体表面展示的多肽的氧化折叠，首次构建具有固定多肽拓扑结构的三元环肽并成功获得特异性和靶标蛋白MDM2结合的环肽配体。虽然该环肽文库性能优异，但是期望能构建更多种类的富含二硫键环肽文库，为发展出拓扑结构种类更多、性能更加优异的环肽配体提供支持和帮助。
[0005]人表皮生长因子受体(EGFR)家族蛋白由四个成员组成：HER1、HER2、HER3和HER4，是I型跨膜生长因子受体，用于激活细胞内信号通路，响应细胞外信号；由细胞内酪本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.定向二硫键多元环肽库构建及配体筛选方法，其特征在于包括以下步骤：1)采用CPIEC基序调控其生成基序间二聚的双二硫键，CPIEC基序具有调控二硫键配对的能力；2)在随机多肽序列中引入一对CPIEC基序和额外的半胱氨酸，多肽氧化成具有特定二硫键配对方式的多元环构型；3)选取CPXXC
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C
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C
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CPXXC多肽骨架为模板，构建噬菌体三元环肽混合文库；4)将构建的噬菌体多元环肽库应用于靶标蛋白筛选，获得能特异性与靶标蛋白结合的多元环肽配体。2.如权利要求1所述定向二硫键多元环肽库构建及配体筛选方法，其特征在于在步骤1)中，所述CPIEC即半胱氨酸
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脯氨酸
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异亮氨酸
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谷氨酸
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半胱氨酸，为人血浆纤维连接蛋白由C端的一个短肽基序形成的一对反平行二硫键连接而成的二聚体；将含有一个CPIEC基序的多肽在碱性条件下于水相中发生氧化反应，生成三种氧化产物，分别为反平行二聚体、平行二聚体和环内二硫键肽单体，产率分别为45％，23％和32％；CPIEC基序具有调控二硫键配对的能力，会调控其生成基序间二聚的双二硫键。3.如权利要求1所述定向二硫键多元环肽库构建及配体筛选方法，其特征在于在步骤2)中，所述在随机多肽序列中引入一对CPIEC基序和额外的半胱氨酸，形成含有两个CPIEC基序的多肽骨架CPIEC
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aa
n
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CPIEC，其中，aa＝任意氨基酸，n＝氨基酸的个数；多肽骨架CPIEC
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aa
n
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CPIEC在碱性条件下于水相中发生氧化反应，生成两种氧化产物；所述两种氧化产物为两个CPIEC反平行配对的氧化产物和平行配对的氧化产物；CPIEC基序在二元环肽中保持调控二硫键配对的优异性质，且其配对方式不受到中间相隔的氨基酸数目的影响；含有两个CPIEC基序和两个C的多肽骨架在碱性条件下于水相中发生氧化反应，生成的氧化主产物是两个CPIEC正交性配对(生成反平行双二硫键)和两个C配对的产物，表明CPIEC在三元环肽中仍然保留其反平行配对的固有性质。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴川六，路帅敏，范诗卉，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：