基于纳米表面等离子共振技术的药物筛选和表征的检测方法技术

本发明专利技术公开了基于纳米表面等离子共振技术的药物筛选和表征的检测方法，属于抗体蛋白亲和力检测和抗体药物筛选和表征技术领域。本检测方法是将基于NanoSPR芯片用固定配体包覆后，加入待测分析物，然后进样检测，利用特定的拟合曲线方程获得最终的蛋白

【技术实现步骤摘要】
基于纳米表面等离子共振技术的药物筛选和表征的检测方法


[0001]本专利技术属于抗体蛋白亲和力检测和抗体药物筛选和表征
，特别是基于纳米表面等离子共振技术的药物筛选和表征的检测方法。

技术介绍

[0002]识别和检测化合物和蛋白质之间的相互作用，即蛋白质(或抗体)与抗原之间的亲和力，对发现现有抗体类药物的新用途，发现、开发和筛选安全有效的抗体类药物具有重要意义；能够揭示未知的化合物蛋白质相互作用，有助于预测潜在的副作用，分析检测抗体药物的表征。现有的蛋白质亲和力检测技术通常采用计算机软件模拟或统计学的方法进行评价检测。
[0003]表面等离子共振(SPR)主要是建立在全反射模式上，利用衰减全反射棱镜耦合方法，实现激光激发表面等离子波，通过检测全反射角度的变化，引起消光光谱的移动，进而获取生化反应的信息。现有技术中已经有人利用表面等离子共振芯片检测抗体蛋白与抗原特异结合的亲和力。例如，中国专利申请CN112625091A提供了一种结合猪瘟病毒Erns蛋白的多肽序列，该多肽序列就是通过将猪瘟Erns蛋白用PBS液和芯片激活缓冲液稀释后，采用活泼酯法，利用装有羧基芯片的SPR检测仪检测猪瘟Erns蛋白与待测目标多肽的相互作用能力。
[0004]纳米表面等离子共振技术(NanoSPR)是一项完全不同于等离子共振芯片技术(SPR)的全新定性定量检测技术，它是在芯片上制作出一排排直径不超过100nm的微孔，通过入射光与金属纳米结构的共振耦合，利用表面等离子体共振的波长对于纳米结构周围介电环境的敏感性，实现对生化反应的检测。当吸附分子的折射率与周围环境的折射率存在差异时，吸附于基底表面的生物分子与目标分子的反应会改变基底表面的折射率，从而引起共振峰的变化，实现目标物质的检测。因此，纳米表面等离子体传感器的共振分析过程无需使用传统SPR技术那样的复杂光学系统。
[0005]构建一种快速、可靠的动态检测蛋白质结合与解离的方法对药物的筛选及应用、病毒的早期检测尤为重要。通过检测蛋白质结合与解离过程获得蛋白质亲和力的方法较多，但仍存在应用局限性。目前，还未发现有人将NanoSPR技术应用于蛋白质亲和力检测中。

技术实现思路

[0006]针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了一种操作简单，免标记，高通量，便携和实时的检测蛋白质结合与解离的方法，该方法可以应用于药物筛选和表征的检测判断中，具体通过以下技术实现。
[0007]基于纳米表面等离子共振技术的药物筛选和表征的检测方法，首先使用固定配体包被NanoSPR芯片，再将待测分析物结合到NanoSPR芯片上，检测得到结合动力曲线和解离动力曲线，最后进行药物筛选和表征的检测。
[0008]优选地，上述方法中，使用固定配体包被NanoSPR芯片，将待测分析物结合到
NanoSPR芯片上，测得结合动力曲线和解离动力曲线的具体步骤包括：
[0009]S1、清洗若干NanoSPR芯片，在NanoSPR芯片上加入固定配体工作液，覆膜后静置；甩掉废弃固定配体工作液，依次加入封闭液和保护液进行封闭、保护，甩掉废弃保护液后，干燥待用；
[0010]S2、制备不同浓度梯度的待测分析物工作液，将不同浓度的待测分析物工作液加至步骤S1得到的NanoSPR芯片上；
[0011]S3、采用特定波长进行动力学检测，结合5
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15min测得结合动力曲线；然后解离15
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30min测得解离动力曲线；最后采用计算机软件，利用结合动力曲线方程和解离动力曲线方程，拟合获得平衡亲和力常数K
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。
[0012]本专利技术提供的上述操作简单、免标记、高通量、易便携和实时检测待测分析物(例如普通蛋白质、抗体、多肽，以及食品中的磺胺、黄曲霉毒素等小分子化合物)与固定配体的结合与解离的NanoSPR生物芯片检测方法。该方法将纳米表面等离子共振技术(NanoSPR)应用于检测待测分析物(主要是蛋白质类)结合与解离过程中，检测得到的平衡亲和力常数K
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与目前文献中采用普通方法报道的试验结果基本一致。随后通过与已经商业化应用的Biacore系统进行对比，结果同样显示本专利技术所得到的检测结果具有非常高的可靠性和准确度。本方法的待测分析物与固定配体的结合、解离过程仅需20
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25min即可实现蛋白质动力学快速检测的需求，为实时检测蛋白质结合与解离动力学提供了高效、可靠的方法。这种方法能够广泛应用于抗体类药物的筛选、表征等分析方面，为抗体药物药效筛选，病毒早期检测等领域提供了一种新手段。
[0013]所述待测分析物可以是抗原、抗体、普通蛋白、普通多肽、常见用作检测的小分子物质等。具体地，待测分析物可以为新冠病毒抗体蛋白、肿瘤标志物抗体蛋白，也可以是食品检验中的小分子化合物磺胺、黄曲霉毒素等；而固定配体则是可以与待测分析物结合的物质。待测分析物并不一定必须是抗体，相应地，固定配体也不一定必须是抗原。例如，如果待测分析物是抗原，则固定配体则是能与抗原特异性结合的抗体；如果待测分析物是抗体，则固定配体则是能被该抗体特异性结合的抗原。由于待测分析物(例如抗体或抗原)与固定配体(例如抗原或抗体)的结合和解离是同时持续发生的动态过程，本专利技术的检测方法的创新点在于，不仅测定获得了待测分析物结合过程的结合曲线，还同时测定了待测分析物解离过程的解离曲线，利用结合曲线和解离曲线获取最终的待测分析物与固定配体的平衡亲和力常数K
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。
[0014]在正式检测方法之前，首先要采用常规的方法，按要求制备得到NanoSPR芯片，例如在基底板材表面压印有矩阵排列的纳米孔，每个纳米孔的顶部直径一般为50
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2000nm、底部直径为50
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2000nm、高度为100
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800nm，相邻纳米孔的间距为100
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4000nm，然后从下至上依次镀有厚度10nm钛膜层、20nm银膜层和10nm金膜层；针对需要测定的待测分析物，确定能够与之特异性结合的固定配体，不同的待测分析物有不同的固定配体。步骤S2中使用一步法，将待测分析物与固定配体结合后，直接放入光谱仪(例如XLement SPR100)进行全光谱扫描。步骤S3中，在检测是一般先通过全光谱扫描获得最佳波长(例如可以选择575nm和600nm波长)，然后再进行动力学检测，最后利用计算机软件拟合方程后得到待测分析物与固定配体的平衡亲和力常数K
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值。
[0015]优选地，步骤S1中，加入的封闭液是是将牛血清白蛋白、酪蛋白、牛奶、聚乙二醇
20000中至少一种溶解于缓冲液中制成的复合液，封闭方法为室温放置1
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2h；加入的保护液为糖类(例如葡聚糖、葡萄糖、蔗糖或海藻糖)溶解于缓冲液中制成的复合液，保护方法为37℃保护5
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30min。
[0016]更优选地，步骤S1中，所用的缓冲液为CBS缓冲液、PBS缓冲液、TBS缓冲液、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于纳米表面等离子共振技术的药物筛选和表征的检测方法，其特征在于，首先使用固定配体包被NanoSPR芯片，再将待测分析物结合到NanoSPR芯片上，检测得到结合动力曲线和解离动力曲线，最后进行药物筛选和表征的检测。2.根据权利要求1所述的基于纳米表面等离子共振技术的药物筛选和表征的检测方法，其特征在于，使用固定配体包被NanoSPR芯片，将待测分析物结合到NanoSPR芯片上，测得结合动力曲线和解离动力曲线的具体步骤包括：S1、清洗若干NanoSPR芯片，在NanoSPR芯片上加入固定配体工作液，覆膜后静置；甩掉废弃固定配体工作液，依次加入封闭液和保护液进行封闭、保护，甩掉废弃保护液后，干燥待用；S2、制备不同浓度梯度的待测分析物工作液，将不同浓度的待测分析物工作液加至步骤S1得到的NanoSPR芯片上；S3、采用特定波长进行动力学检测，结合5
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15min测得结合动力曲线；然后解离15
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30min测得解离动力曲线；最后采用计算机软件，利用结合动力曲线方程和解离动力曲线方程，拟合获得平衡亲和力常数K
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。3.根据权利要求2所述的基于纳米表面等离子共振技术的药物筛选和表征的检测方法，其特征在于，步骤S1中，加入的封闭液是将牛血清白蛋白、酪蛋白、牛奶、聚乙二醇20000中至少一种溶解于缓冲液中制成的复合液，封闭方法为室温放置1
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2h；加入的保护液是将糖类溶解于缓冲液中制成的复合液，保护方法为37℃保护5
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30min。4.根据权利要求3所述的基于纳米表面等离子共振技术的药物筛选和表征的检测方法，其特征在于，步骤S1中，所用的缓冲液为CBS缓冲液、PBS缓冲液、TBS缓冲液、Hanks缓冲液或HEPES。5.根据权利要求2所述的基于纳米表面等离子共振技术的药物筛选和表征的检测方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄丽萍，刘钢，樊洪利，曾少奇，王易，
申请(专利权)人：量准武汉生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：