用于RAA恒温扩增的免提取快速释放核酸的裂解液及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于RAA恒温扩增的免提取快速释放核酸的裂解液及其应用，涉及核酸提取检测技术领域，具体为为50

【技术实现步骤摘要】
用于RAA恒温扩增的免提取快速释放核酸的裂解液及其应用


[0001]本专利技术涉及核酸提取检测
，特别涉及用于RAA恒温扩增的免提取快速释放核酸的裂解液及其应用。

技术介绍

[0002]核酸是物种遗传性息的携带者，是基因表达的物质基础，无论是进行核酸结构研究还是功能研究，首先都需要对物种核酸进行分离和纯化。目前针对核酸提取，最主要的技术包括酚/氯仿抽提法、醇沉淀法、层析柱法、热裂解碱法、煮沸裂解法、纳米磁珠法、还有超声法、反复冻融法、酶解法及低渗裂解等等多种方法。这些方法使用的存在很大的局限性，需要专业的技术人员以及相关的技术设备和试剂，花费大量时间，才能达到提取核酸的目的，当如果出现需要大量样本前处理的时候，这些常规方法需要消耗大量人力和物力以及时间成本。因此建立快速提取核酸且适用于目前国内核酸检测这个需要大规模样本前处理的核酸提取方法和试剂具有重要的现实意义。
[0003]重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification，RAA)的简称，是一种利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在等温条件下(最佳温度37℃
‑
39℃)进行核酸扩增的技术，并结合荧光即时检测，实现5
‑
20min输出结果，灵敏度达到10copies/测试。现有技术中，对于核酸的裂解普遍使用的裂解液为含有胍盐的裂解液。胍盐是一种强蛋白质变性剂，高浓度胍盐可迅速破坏裂解细胞，使核酸释放。但是这种使用含有胍盐的裂解液裂解之后，在荧光检测之前必须采用各种方式对裂解产物进行纯化处理，否则会严重影响荧光检测结果的准确度。
[0004]例如中国专利申请CN112680547A提供了一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其应用，公开的灭活裂解液的原料包括铵盐、异硫氰酸胍、氯化锂、乙二胺四乙酸、乙二醇双(2
‑
氨基乙基醚)四乙酸、表面活性剂、抗坏血酸、二硫苏糖醇和缓冲剂。这种灭活裂解液就是利用的胍盐的特殊作用完成细胞裂解，其说明书就提到使用磁性材料(磁珠)进行吸附核酸，然后再用洗脱液进行相当长时间的洗涤和洗脱，非常不利于核酸快速检测。又例如中国专利申请CN113512546A提供了一种快速质粒DNA抽提纯化试剂盒，虽然其裂解液原料只有KOH或NaOH 100mM
‑
2M，1％十二烷基苯磺酸钠/十二烷基磺酸钠/十二烷基硫酸钠1g/100ml；但是还使用了原料为盐酸胍1M
‑
6M，醋酸钾或醋酸钠100mM
‑
1M，并用醋酸调节pH至2
‑
8的中和液；在裂解后同样需要使用中和液处理裂解产物，然后还要过硅胶柱、清洗和洗脱，这同样耗费了相当长的时间。
[0005]现有技术中也有不使用胍盐为主要原料的核酸裂解液，例如中国授权专利CN105420230B提供了一种磁珠法提取核酸的裂解液，其原料包括0.2
‑
0.4N NaOH、0.3
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0.6M KCl、0.01
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0.05％N
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月桂酰肌氨酸钠、5mM EDTA、0.3
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0.6M Tris
‑
HCl和1
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2％Triton X
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100组成。然而该专利主要研究的是磁珠法提取核酸，所要解决的是胍盐裂解液稀释度下降不利于DNA回收效率，以及胍盐成分不稳定的技术问题；并且，该专利虽然未使用胍盐裂解液，并将裂解时间缩短至5
‑
10min，但是在整个PCR扩增的过程中，需要先将这种裂解液与磁珠
混合静置，然后把磁珠进行分离和洗涤，这个过程时间也会很长。因此总体而言，操作仍然较为繁琐，总体耗时也较长。这种核酸裂解液组分复杂，未经过纯化的裂解产物会抑制后续的扩增检测。
[0006]又例如中国专利申请CN111074007A提供的检测SARS
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Cov
‑
2病毒的恒温扩增试剂盒，使用的灭活裂解液包括0.01
‑
0.1M的NaOH，体积比0.1％
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0.5％的TWEEN
‑
20，体积比0.1％
‑
1％的Triton X
‑
100。这种核酸裂解液表面活性剂的组分影响后续的扩增检测。

技术实现思路

[0007]针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了一种用于RAA恒温扩增的免提取快速释放核酸的裂解液及其应用，具体通过以下技术实现。
[0008]用于RAA恒温扩增的免提取快速释放核酸的裂解液，为50
‑
200mM的NaOH水溶液。
[0009]优选地，用于RAA恒温扩增的免提取快速释放核酸的裂解液为50
‑
100mM的NaOH水溶液。
[0010]更优选地，用于RAA恒温扩增的免提取快速释放核酸的裂解液为80mM的NaOH水溶液。
[0011]一种核酸释放和荧光检测的方法，包括以下步骤：
[0012]S1、取保存在样本保存液中的拭子样本的上清液待用；
[0013]S2、在室温条件下，按照体积比1:(1
‑
50)，取本申请提供的任意一种裂解液和步骤S1的上清液，混合均匀，静置反应5
‑
15min；
[0014]S3、以步骤S2所得混合液为模板，直接进行恒温扩增和荧光检测。
[0015]优选地，步骤S2中，免提取快速释放核酸的裂解液和步骤S1的上清液的体积比为1:25。
[0016]优选地，步骤S2中，混合均匀的方法为1500
‑
3000rpm涡旋混合3
‑
10s。
[0017]优选地，步骤S2中，静置反应的时间为15min。
[0018]优选地，针对HPV16病毒的核酸检测，在步骤S3中，恒温扩增的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。
[0019]更优选地，针对HPV16病毒的核酸检测，步骤S3中，荧光检测所使用的探针是在如SEQ ID NO.3所示的序列上设计四个修饰位点：在距离5
’
端的32bp的中部位置插入dSpacer作为核酸外切酶的识别位点；在dSpacer的上游距离1个碱基的位置标记1个荧光基团；在dSpacer的下游距离1个碱基的位置标记1个淬灭基团；再在3
’
端末端标记一个封闭基团。
[0020]进一步优选地，针对HPV16病毒的核酸检测，步骤S3中，所述封闭基团为胺基、磷酸基团、生物素、生物素
‑
TEG或者C3
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spacer。
[0021]申请人基于单一变量的原则，通过设计大量的试验发现，当使用浓度为50
‑
200mM的NaOH水溶液作为免提取快速释放核酸的裂解液，能够达到快速裂解鼻咽拭子、体液等人体组织样本，释放出样本核酸的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于RAA恒温扩增的免提取快速释放核酸的裂解液，其特征在于，为50
‑
200mM的NaOH水溶液。2.根据权利要求1所述的用于RAA恒温扩增的免提取快速释放核酸的裂解液，其特征在于，为50
‑
100mM的NaOH水溶液。3.根据权利要求2所述的用于RAA恒温扩增的免提取快速释放核酸的裂解液，其特征在于，为80mM的NaOH水溶液。4.一种核酸释放和荧光检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、取保存在样本保存液中的拭子样本的上清液待用；S2、在室温条件下，按照体积比1:(1
‑
50)，取权利要求1
‑
3任一项所述的裂解液和步骤S1的上清液，混合均匀，静置反应5
‑
15min；S3、以步骤S2所得混合液为模板，直接进行恒温扩增和荧光检测。5.根据权利要求4所述的核酸释放和荧光检测的方法，其特征在于，步骤S2中，裂解液和步骤S1的上清液的体积比为1:25。6.根据权利要求4所述的核酸释放和荧光检测的方法，其特征在于，步骤S2中，混合均匀的方法为1500
...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄丽萍，陈友倩，刘钢，何佳俊，
申请(专利权)人：量准武汉生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：