一种CRISPR/Cas调控的DNA银纳米簇传感器及其检测肉类掺假的方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种CRISPR/Cas调控的DNA银纳米簇传感器及其检测肉类掺假的方法和应用，属于食品安全检测技术领域。该DNA模板化银纳米簇传感器引入了新型无标签荧光探针DNA

【技术实现步骤摘要】
一种CRISPR/Cas调控的DNA银纳米簇传感器及其检测肉类掺假的方法和应用


[0001]本专利技术属于食品安全检测
，具体涉及一种CRISPR/Cas调控的DNA银纳米簇传感器及其检测肉类掺假的方法和应用。

技术介绍

[0002]近年，肉类掺假逐渐成为受到全球食品市场关注的问题，尽管国内外已经出台了许多法律来保证和监督肉类的品质，但是肉类掺假现象仍层出不穷。大多数肉类掺假都是将颜色质地相似的低价原料掺入较高价格的产品中，以此获得更高的经济效益，而这些行为不仅输入消费欺诈，还会造成过敏反应、食源性致病菌的传播以及部分人员被迫的宗教信仰违背问题。因此，开发敏感、准确、可靠的检测技术，以保证肉类的真实性和食品安全是十分必要的。
[0003]现存的肉类真实性检测方法主要包括以特征蛋白、特异性代谢物和DNA为标志物的检测技术，例如，质谱(MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)、光谱方法、聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR(qPCR)技术，以及新兴的无损检测(NDT)技术如近红外光谱(NIRS)、高光谱成像(HSI)和拉曼光谱(RS)等。在这些方法中，质谱技术和光谱技术由于可以提供待测物的大量结构信息而具有很好的通用性。无损检测技术适用于需进行多次重复测量和自动化检测形式，在高通量分析和自动化分析方面展现出一定的优势。然而，蛋白质在热加工或较复杂的加工条件下容易降解或变性，因此以蛋白质为目标物的检测方法的可靠性不足。此外，代谢物受动物生长环境和肉类储存、加工条件的影响较大，并且代谢物的物种特异性目前还存在一些争议，因此基于代谢物图谱的技术在实现肉类掺假的检测方面还不具有足够的说服力。相比之下，核酸具有公认的物种特异性、种间多态性以及热稳定性，是一种具有特异性和准确性的标志物。传统的PCR和qPCR技术具有良好的特异性和敏感性，然而其广泛应用被精密的设备要求、严格的实验环境要求和专业的人员要求所限制。此外，由于复杂的食品基质，极低的目标DNA含量以及多种多样掺假方法，更高特异性、更灵敏的检测技术亟待开发。

技术实现思路

[0004]为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种CRISPR/Cas调控的DNA银纳米簇传感器及其检测肉类掺假的方法和应用，为肉类掺假检测提供检测方案。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0006]本专利技术公开了一种CRISPR/Cas调控的DNA银纳米簇传感器，包括CRISPR/Cas体系和DNA模板化银纳米簇；
[0007]其中，CRISPR/Cas体系由Cas12a蛋白、crRNA、RNA酶抑制剂、缓冲液以及扩增后的目标掺假样品DNA构成；DNA模板化银纳米簇由含银离子的溶液、NaBH4和DNA模板合成得到；其中，crRNA的识别序列与目标掺假样品DNA片段互补；DNA模板的序列如SEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.12、SEQ.ID.NO.13或SEQ.ID.NO.14所示。
[0008]优选地，所述掺假样品为鸭肉，鸭肉样品DNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示；crRNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示。
[0009]优选地，DNA模板的序列为C
‑
G4。
[0010]进一步优选地，扩增为环介导等温扩增，扩增所用引物包括鸭肉
‑
FIP引物、鸭肉
‑
BIP引物、鸭肉
‑
F3引物、鸭肉
‑
B3引物、鸭肉
‑
LF引物和鸭肉
‑
LB引物；其中，所述鸭肉
‑
F3引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，鸭肉
‑
B3引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，鸭肉
‑
FIP引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO3所示，鸭肉
‑
BIP引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，鸭肉
‑
LF引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，鸭肉
‑
LB引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。
[0011]优选地，所述含银离子的溶液为AgNO3；DNA模板、AgNO3和NaBH4的摩尔比为1：(6～40)：(6～40)。
[0012]进一步优选地，DNA模板与Ag
+
的摩尔比为1:30。
[0013]优选地，缓冲液为10
×
NEBuffer 2.1。
[0014]优选地，DNA模板的浓度为1、10、20、50、75或100μM。
[0015]进一步优选地，DNA模板的浓度为50μM。
[0016]本专利技术还公开了上述一种CRISPR/Cas调控的DNA银纳米簇传感器检测肉类掺假的方法，首先提取目标掺假样品DNA并进行LAMP扩增，然后用扩增产物激活Cas12a蛋白，以DNA模板化银纳米簇作为Cas12a蛋白酶切反应的底物，剪切完成后经荧光光谱仪扫描，以空白组和实验组在570nm处的荧光强度差为信号建立标准曲线，根据标准曲线测定含未知浓度的肉类样品中目标掺假样品DNA含量。
[0017]优选地，DNA模板化银纳米簇的制备方法为：将银纳米簇DNA模板序列在95℃加热后，在室温下冷却，加入含银离子的溶液后，在4℃避光孵育1h，之后加入NaBH4并涡旋，4℃避光孵育0～12h，制得DNA模板化银纳米簇。
[0018]进一步优选地，银纳米簇DNA模板序列的孵育时间为2h。
[0019]优选地，LAMP扩增条件为65℃，30min；剪切条件为在37℃反应30min。
[0020]本专利技术还公开了上述一种CRISPR/Cas调控的DNA银纳米簇传感器在检测肉类掺假中的应用。
[0021]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0022]本专利技术提供的一种CRISPR/Cas调控的DNA银纳米簇传感器，利用基因编程工具CRISPR/Cas12a的特异性识别和反式切割活性来进行微量核酸的灵敏检测，该传感器克服了CRISPR/Cas技术基于有机染料和猝灭剂的荧光信号输出过程中的问题，如有机化学荧光材料的生物相容性相对较差，成本较高，以及由于复杂基质中的各种离子、在激发光中过长时间的暴露、由散射光和自身荧光引起的背景干扰，导致荧光猝灭以及假阳性结果等等。传感器中的新型无标签荧光探针DNA模板化银纳米簇(DNA
‑
AgNCs)是天然的集成探针，合成时无需化学修饰和荧光基团的连接，仅通过还原Ag
+
来制备。合成的纳米材料由几个到几十个Ag原子和DNA支架稳定的纳米团簇组成，在成核区域金属核的形成对DNA的化学性质的影响可忽略不计，而DNA模板的降解会伴随着荧光强度的明显下降。DNA
‑
AgNCs具有易于合成、高光稳定性、毒性低及低成本等特点，生物相容性更好，能够表现本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR/Cas调控的DNA银纳米簇传感器，其特征在于，包括CRISPR/Cas体系和DNA模板化银纳米簇；其中，CRISPR/Cas体系由Cas12a蛋白、crRNA、RNA酶抑制剂、缓冲液以及扩增后的目标掺假样品DNA构成；DNA模板化银纳米簇由含银离子的溶液、NaBH4和DNA模板合成得到；其中，crRNA的识别序列与目标掺假样品DNA片段互补；DNA模板的序列如SEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.12、SEQ.ID.NO.13或SEQ.ID.NO.14所示。2.如权利要求1所述的一种CRISPR/Cas调控的DNA银纳米簇传感器，其特征在于，所述掺假样品为鸭肉，鸭肉样品DNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示；crRNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示。3.如权利要求2所述的一种CRISPR/Cas调控的DNA银纳米簇传感器，其特征在于，扩增为环介导等温扩增，扩增所用引物包括鸭肉
‑
FIP引物、鸭肉
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BIP引物、鸭肉
‑
F3引物、鸭肉
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B3引物、鸭肉
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LF引物和鸭肉
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LB引物；其中，所述鸭肉
‑
F3引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，鸭肉
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B3引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，鸭肉
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FIP引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO3所示，鸭肉
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BIP引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，鸭肉
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LF引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘江花，陈嘉蕙，李国梁，吴永宁，李琳，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：