一种基于RPA-LFD检测的荧光探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开一种基于RPA

【技术实现步骤摘要】
一种基于RPA
‑
LFD检测的荧光探针及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于检测
，具体涉及一种基于RPA
‑
LFD检测的荧光探针及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]华支睾吸虫是一种重要的食源性人兽共患寄生虫，寄生在人与多种哺乳动物的肝胆管及胆囊中，引起华支睾吸虫病。临床造成胆道阻塞、胆管炎肝硬化严重者可引起胆管上皮癌，2009年WHO将华支睾吸虫归为Ⅰ类生物性致癌因子。全球有超过2亿人存在感染华支睾吸虫的风险，而中国的18个省均有华支睾吸虫病的报道，感染人数达600万之多，对华支睾吸虫病的防控不容忽视。
[0003]华支睾吸虫病的诊断方法包括病原学、影像学、分子生物学及免疫学等，但是目前仍旧以粪便虫卵检查为主，粪便中检测到虫卵是诊断该病的金标准。病原学诊断方法具有一定的优势，其也存在弊端：如由于华支睾吸虫虫卵和后睾吸虫虫卵较为相似，所以对操作人员的经验和专业性要求较高；在轻度感染时易发生误检或漏检。免疫学方法中的酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫层析试验(ICTs)和时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)具有相当高的灵敏度，可用于流行病学研究和大规模疾病监测，但是，这些方法容易产生较高的交叉反应和假阳性率，并且很难区分当前感染和以前感染。分子生物学方法具有很高的灵敏度和特异性，目前已开发了多种基于PCR的诊断方法用以检测样本中华支睾吸虫的DNA，如常规PCR、实时PCR、巢式PCR和多重PCR等，尽管基于PCR的检测具有高度的灵敏度，并且可以检测较低的寄生虫基因组，但对特定工具(如PCR仪等)的需求限制了其在资源有限的环境中的应用。
[0004]重组酶聚合酶扩增联合侧流层析试纸条(RPA
‑
LFD)是一种等温DNA扩增技术，主要依赖于重组酶、单链结合蛋白(SSB)、DNA聚合酶实现恒定温度下扩增靶基因，该方法在20分钟内便可完成靶基因的扩增，与传统的PCR方法相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，操作简单，时间较短，已广泛用于病毒、细菌、寄生虫诊断中。此外，RPA扩增产物可进一步与试纸条等检测设备相结合，做到轻松读取检测结果，使端点分析更加灵活，实现精准、快速、可视化的检测目标，克服部分基层检测实验室因设备落后无法现场检测的难题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了提供一款提高RPA
‑
LFD检测试剂盒灵敏度、准确度的荧光探针。
[0006]本专利技术提供一种基于RPA
‑
LFD检测的荧光探针，所述荧光探针的序列如下所示：[荧光基团]‑
CTTTCTGCTTCTGTAATTGATGCCTTGTTT
‑
[THF]‑
CATGATACTTGGTTTG
‑
[淬灭基团]。
[0007]进一步地限定，荧光基团为FAM，淬灭基团为C3 Spacer。
[0008]进一步地限定，FAM的分子式是C
27
H
18
N2O8；C3 Spacer的分子式是C
33
H
43
N2O5P；THF的分子式是C4H8O。
[0009]本专利技术提供一种上述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：荧光探针是在CTTTCTGCTTCTGTAATTGATGCCTTGTTTCATGATACTTGGTTTG探针序列中5'端由FAM荧光基团修饰，距5'端30bp处插入THF基团，3'端由C3
‑
Spacer基团修饰获得的。
[0010]本专利技术提供上述的荧光探针或上述的制备方法在制备检测华支睾吸虫的试剂盒中的应用。
[0011]本专利技术提供一种检测华支睾吸虫的试剂盒，所述试剂盒含有上述荧光探针、上游引物、5'端偶联生物素的下游引物和启动剂。
[0012]进一步地限定，所述5'端偶联生物素的下游引物的序列如下：Biotin
‑
TACAGAAATAACAACCGTCCTAAACGACCCTA。
[0013]进一步地限定，Biotin的分子式是C10H18N4O2S。
[0014]进一步地限定，启动剂的成分为280mM醋酸镁。
[0015]进一步地限定，所述试剂盒的反应体系为50μL：25μL反应缓冲液，10μM的2.1μL上游引物，10μM的2.1μL下游引物，10μM的0.6μL探针，16.2μL ddH2O，1μL华支睾吸虫DNA，280mmol/L的3μL启动剂。
[0016]有益效果：1.用时短，效率高：RPA扩增过程只需20min，与传统PCR相比极大缩短了反应时间；
[0017]2.扩增温度恒定：RPA在恒温37℃即可完成靶基因扩增，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，不需要昂贵的仪器设备(如PCR仪等)，克服了部分基层检测点因设备落后无法现场检测的难题。
[0018]3.操作简便：扩增所需要的酶和试剂以粉末的形式放置于独立的反应管中，可常温放置，扩增时只需要加入相应的缓冲液、引物、探针、模板及启动剂即可开始反应，对操作人员要求低，适用于基层检测点的现场诊断；
[0019]4.特异性强：本专利技术试剂盒中添加了探针，可用于精准诊断华支睾吸虫，与其它种类寄生虫无交叉反应；
[0020]5.灵敏度高：本专利技术所设计的华支睾吸虫RPA引物和探针能够在37℃，扩增20min条件下核酸检出限为100fg。
[0021][FAM]‑
CTTTCTGCTTCTGTAATTGATGCCTTGTTT
‑
[THF]‑
CATGATACTTGGTTTG
‑
[C3 Spacer]三个基团是必须要加的，其中THF不可以替换，探针中引入四氢呋喃修饰位点，四氢呋喃修饰核苷酸，在DNA聚合酶作用下，可以几乎100％效率实现DNA链延伸；当探针同靶序列结构形成双链DNA，Nfo酶在巡视过程中遇到四氢呋喃修饰位点则认为DNA出现损伤需要进行修复，故对探针上的该位点进行剪切，从而释放荧光基团；剪切后的探针，具有游离3
‘‑
OH，所以可以作为引物继续合成新模板。FAM和C3 Spacer是荧光基团和淬灭基团，可以被其他同功能的类型的所取代。
附图说明
[0022]图1为本专利技术RPA
‑
LFD检测结果判定示意图。其中T为检测线；C为质控线；a为无效结果示意图；b为阴性结果示意图；c为阳性结果示意图；
[0023]图2为本专利技术RPA
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LFD特异性分析。其中T为检测线；C为质控线；a为阴性对照；b为东方次睾吸虫；c为旋毛虫；d为异尖线虫；e为华支睾吸虫；
[0024]图3为本专利技术RPA
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LFD灵敏度分析；
[0025]图4为普通PCR灵敏度分析，M为DNA Marker，1
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8模板DNA浓度依次为100ng、10本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于RPA
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LFD检测的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的序列如下所示：[荧光基团]
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CTTTCTGCTTCTGTAATTGATGCCTTGTTT
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[THF]
‑
CATGATACTTGGTTTG
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[淬灭基团]。2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，荧光基团为FAM，淬灭基团为C3 Spacer。3.根据权利要求2所述的荧光探针，其特征在于，FAM的分子式是C
27
H
18
N2O8；C3 Spacer的分子式是C
33
H
43
N2O5P；THF的分子式是C4H8O。4.权利要求1
‑
3任一项所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：荧光探针是在CTTTCTGCTTCTGTAATTGATGCCTTGTTTCATGATACTTGGTTTG探针序列中5'端由FAM荧光基团修饰，距5'端30bp处插入THF基团，3'...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓雷，刘明远，马晓晓，唐斌，杨勇，李辰，丁静，金雪敏，徐凝，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：