一种马铃薯早疫病致病菌茄链格孢菌的可视化检测方法技术

本发明专利技术公开了一种马铃薯早疫病致病菌茄链格孢菌的可视化检测方法，结合LAMP和CRISPR/Cas12a实现对茄链格孢菌的高特异性和高灵敏度检测，然后利用AuNPs实现检测结果的可视化；该方法可以检测到100copies/μL的茄链格孢菌质粒模板DNA和10

【技术实现步骤摘要】
一种马铃薯早疫病致病菌茄链格孢菌的可视化检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，特别是一种马铃薯早疫病致病菌茄链格孢菌的可视化检测方法。

技术介绍

[0002]马铃薯早疫病主要是由茄链格孢菌(Alternaria solani)引起的一种严重威胁马铃薯生产的病害，在世界各处的马铃薯种植地都普遍发生。针对这种致病菌，杀菌剂的效果较为显著，但长期使用杀菌剂会导致病菌耐药性的增加。所以开发出一种能够在早期迅速而灵敏地检测Alternaria solani的方法是十分重要的。
[0003]目前对于Alternaria solani的检测方法主要是实时荧光定量PCR(Quantitative real
‑
time polymerase chain reaction，qPCR)和环介导等温扩增(Loop
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mediated isothermal amplification，LAMP)法，qPCR法对仪器、操作人员和检测场地的高要求以及对热循环的需求，使其不能被应用于现场即时检测(Point
‑
of
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care testing，POCT)。基于LAMP的检测方法虽然解决了以上问题，但这个方法特异性低，假阳性率高。成簇规则间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR相关(CRISPR
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associated，Cas)蛋白系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种用来对抗入侵的病毒和外源DNA的适应性免疫防御系统。这些系统在识别并切割靶标DNA或靶标RNA以后，会激活他们的反式切割活性，这为高特异性的、高灵敏度的核酸检测方法提供了基础。金纳米颗粒(Gold nanoparticles，AuNPs)凭借其固有的光学稳定性、高消光系数和局部表面等离子体共振等特殊光学特性，在POCT中应用前景广阔。
[0004]因此，亟待开发一种马铃薯早疫病致病菌茄链格孢菌的可视化检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种马铃薯早疫病致病菌茄链格孢菌的可视化检测方法，实现对茄链格孢菌的高特异性和高灵敏度检测，然后利用AuNPs实现检测结果的可视化。
[0006]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
[0007]一种马铃薯早疫病致病菌茄链格孢菌的可视化检测方法，包括以下步骤：
[0008]S1、提取茄链格孢菌中基因组DNA作为LAMP反应的模板即茄链格孢菌模板DNA，并进行LAMP扩增；
[0009]S2、利用crRNA特异性靶向并结合茄链格孢菌模板DNA的扩增产物，激活Cas12a对附近Reporter DNA或Linker ssDNA的非特异性切割活性，利用CRISPR/Cas12a进行酶切反应，并将含有Reporter DNA的反应通过PCR仪实时监测荧光，保留含有Linker ssDNA的反应产物用于后续可视化检测；
[0010]S3、使用盐老化法制备了两种DNA功能化的AuNPs，两种DNA功能化的AuNPs通过Linker ssDNA连接起来而发生聚集，用肉眼观看颜色变化或者用酶标仪测量混合物的吸光
度。
[0011]进一步地，所述步骤S1中LAMP扩增具体包括：
[0012]按照WarmLAMP kit(DNA&RNA)的说明进行LAMP扩增，扩增反应体系为25μL，其中包含WarmStart LAMP 1
×
Master Mix，1
×
引物混合物，0.5
×
SYBR GreenⅠ和茄链格孢菌模板DNA，其中引物混合物包括0.2μM的F3、0.2μM的B3、1.6μM的FIP、1.6μM的BIP、0.4μM的LF和0.4μM的LB；混匀后置于PCR仪中在65℃下反应，每1.5min采集一次荧光信号。
[0013]进一步地，所述步骤S2中CRISPR/Cas12a进行酶切反应具体包括：
[0014]将Cas12a与crRNA按照浓度比Cas12a：crRNA＝1：1.25的比例在NE Bufferr2.1的DEPC水溶液中37℃下预组装10min，然后将形成的Cas12a/crRNA复合物加入到另一个反应体系中，使得最终反应体系体积为25μL，其中包含500nMReporter DNA或Linker ssDNA，1
×
NEBufferr2.1，150nMCas12a，187.5nMcrRNA和和茄链格孢菌模板DNA的扩增产物；于43℃反应，含有Reporter DNA的反应通过PCR仪实时监测荧光，保留含有Linker ssDNA的反应产物以用于后续可视化检测。
[0015]进一步地，所述步骤S3具体包括：
[0016]S31、于室温下分别以浓度比为DNA1/DNA2:TCEP＝1：100的比例将DNA1和DNA2还原，再按照浓度比为1：300的比例将AuNPs与经预处理的巯基DNA混合室温下孵育过夜，在混合物中分批缓慢加入0.2M磷酸缓冲液(含2MNaCl)，使NaCl最终浓度为0.2M；然后用10mM磷酸缓冲液洗涤3次，离心除去多余的DNA，用上述10mM磷酸缓冲液重悬沉淀，检测重悬后的AuNP
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DNA1和AuNP
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DNA2的浓度，于4℃保存；
[0017]S32、根据所测得AuNP
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DNA1和AuNP
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DNA2的浓度，将AuNP
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DNA1和AuNP
‑
DNA2按浓度比1：1混合均匀后加入到步骤S2中的含有Linker ssDNA的反应产物里面，使体系中三种成分浓度比为AuNP
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DNA1：AuNP
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DNA2：Linker ssDNA＝1：1：50，然后在反应体系中加入5M的NaCl溶液，使NaCl最终浓度为750mM，室温孵育5min，用肉眼观看颜色变化或者用酶标仪测量混合物的吸光度。
[0018]优选地，所述步骤S31中，0.2M磷酸缓冲液由2M NaCl、200mM Na2HPO4和200mM NaH2PO4组成，所述0.2M磷酸缓冲液的pH为7.4；所述10mM磷酸缓冲液由10mM Na2HPO4和10mMNa2HPO4组成，所述10mM磷酸缓冲液的pH为7.4。
[0019]优选地，所述步骤S31中离心的转速为12000rpm，离心时间为20min。
[0020]与现有技术相比，本专利技术结合LAMP和CRISPR/Cas12a实现对茄链格孢菌的高特异性和高灵敏度检测，然后利用AuNPs实现检测结果的可视化；该方法可以检测到10
‑3ng/μL的茄链格孢菌模板DNA，并且用肉眼可以见到明显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种马铃薯早疫病致病菌茄链格孢菌的可视化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、提取茄链格孢菌中基因组DNA作为LAMP反应的模板即茄链格孢菌模板DNA，并进行LAMP扩增；S2、利用crRNA特异性靶向并结合茄链格孢菌模板DNA的扩增产物，激活Cas12a对附近Reporter DNA或Linker ssDNA的非特异性切割活性，利用CRISPR/Cas12a进行酶切反应，并将含有Reporter DNA的反应通过PCR仪实时监测荧光，保留含有Linker ssDNA的反应产物用于后续可视化检测；S3、使用盐老化法制备了两种DNA功能化的AuNPs，两种DNA功能化的AuNPs通过Linker ssDNA被连接起来而发生聚集，用肉眼观看颜色变化或者用酶标仪测量混合物的吸光度。2.根据权利要求1所述的马铃薯早疫病致病菌茄链格孢菌的可视化检测方法，其特征在于，所述步骤S1中LAMP扩增具体包括：按照LAMP kit(DNA&RNA)的说明进行LAMP扩增，扩增反应体系为25μL，其中包含WarmStart LAMP 1
×
Master Mix，1
×
引物混合物，0.5
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SYBR Green
ꢀⅠ
和茄链格孢菌模板DNA，其中引物混合物包括0.2μM的F3、0.2μM的B3、1.6μM的FIP、1.6μM的BIP、0.4μM的LF和0.4μM的LB；混匀后置于PCR仪中在65℃下反应，每1.5min采集一次荧光信号。3.根据权利要求1所述的马铃薯早疫病致病菌茄链格孢菌的可视化检测方法，其特征在于，所述步骤S2中CRISPR/Cas12a进行酶切反应具体包括：将Cas12a与crRNA按照浓度比Cas12a：crRNA＝1：1.25的比例在NE Buffer r2.1的DEPC水溶液中37℃下预组装10min，然后将形成的Cas12a/crRNA复合物加入到另一个反应体系中，使得最终反应体系体积为25μL，其中包含500nMReporter DNA或Linker ssDNA，1
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NEBufferr2.1，150nMCas12a，187...

【专利技术属性】
技术研发人员：王迪，郭航宇，胡青织，张雅琴，李迎春，王佳思，逯家辉，杨家奇，黄诗琪，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：