滚环扩增诱导酶开关激活的方法技术

本发明专利技术涉及一种滚环扩增诱导酶开关激活的方法。该方法以被二价铜离子(Cu

【技术实现步骤摘要】
滚环扩增诱导酶开关激活的方法
一、

[0001]本专利技术介绍了一种滚环扩增诱导酶开关激活的方法。该方法以被二价铜离子(Cu
2+
)抑制了催化活性的辣根过氧化物酶(HRP)为酶开关(HRP
‑
Cu
2+
)，以核酸滚环扩增中产生的焦磷酸根离子(PPi)为激活剂，基于PPi对Cu
2+
强的络合作用来恢复HRP的活性，激活酶开关。
二、
技术介绍

[0002]生物酶是自然界中广泛存在的生物催化剂，它参与调节生物有机体的每一个生物过程。由于生物酶具有高底物特异性和高催化活性，在农业生产、工业制造、生物技术、化学、医学、环境等很多领域都得到了广泛的应用。在分析化学中，利用生物酶作为信标分子，通过生物酶对底物的酶促反应，实现信号的放大，基于此已经发展了多种高灵敏的电化学、化学发光、比色、荧光等分析方法。
[0003]HRP是目前研究最广泛的生物过氧化物酶，由于它的高稳定性和即时可用性，HRP经常用于蛋白质和核酸的检测。例如：在蛋白质检测中，用带有HRP的二抗识别蛋白质，然后加入无色底物四甲基联苯胺(TMB)或者2，2
′‑
联氮双(3
‑
乙基苯并噻唑啉
‑6‑
磺酸)二铵盐(ABTS)，HRP可以催化TMB产生蓝色的产物或者催化ABTS产生绿色的产物，通过对这些有色产物进行肉眼观测或吸光度测定，实现对靶标蛋白质的定性及定量分析。由于基于HRP酶促反应的检测方法具有稳定性好、响应速度快、催化效率高、成本低等优点，已广泛应用于商品化的蛋白质试剂盒，如酶联免疫分析(ELISA)类试剂盒。然而在这些应用中HRP作为信标分子需要标记在二抗上，且都是异相分析方法，常需要洗涤、分离等步骤，其临床应用受到一定的限制。
[0004]Cu
+
是HRP的强抑制剂，当Cu
+
存在时，HRP的活性被抑制，从而不能催化底物进行显色反应，基于此现象，HRP被用于发展了一些均相检测方法。例如，由于Cu
+
可通过抗坏血酸还原Cu
2+
生成，所以基于HRP的抑制发展了均相检测Cu
2+
的比色方法；另外，PPi对Cu
2+
有强的络合作用，且抗坏血酸不能还原被PPi络合后的Cu
2+
，所以基于HRP的抑制又进一步发展了均相检测PPi及其水解酶如焦磷酸酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶等的方法。虽然这些方法实现了均相检测，然而其检测原理都是基于HRP的活性抑制，而HRP的活性受溶液环境影响较大，所以对检测对象及其样本环境要求高。
[0005]本专利技术基于PPi对Cu
2+
的络合强于HRP对Cu
2+
络合，结合PPi的滚环扩增式生成，设计了一种滚环扩增诱导酶开关激活的方法，该方法可联合HRP催化反应，构建高灵敏的比色、化学发光等分析方法，用于能诱发滚环扩增反应的靶标分子的检测。该方法简单、快捷、灵敏、通用，在生物分析领域有较大的应用前景。
三、
技术实现思路

[0006]本专利技术的内容是：制备酶开关，结合核酸滚环扩增反应，利用PPi对Cu
2+
强的络合作用，发展一种滚环扩增诱导酶开关激活的方法，并联合HRP催化反应，应用于能诱发滚环扩增反应的靶标分子的高灵敏检测。
[0007]本专利技术通过以下技术方案来实现：
[0008]在HRP溶液中加入高浓度的Cu
2+
后，在37℃下反应30分钟，然后通过超滤分离获得HRP
‑
Cu
2+
。得到的HRP
‑
Cu
2+
的浓度通过BCA蛋白质试剂盒标定，其过氧化物酶活性通过鲁米诺化学发光试剂盒测试，相比于HRP，所制的HRP
‑
Cu
2+
的过氧化物酶活性需被抑制了90％以上。
[0009]将引物DNA加入含有模板DNA、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、核酸连接酶SplintR及聚合酶phi29的溶液中，在37℃下进行滚环扩增1小时，随即加温至65℃并温育10分钟终止滚环扩增反应。
[0010]把上述制备的HRP
‑
Cu
2+
溶液和滚环扩增的完成溶液混合并室温下反应5分钟，然后加入化学发光底物或显色底物，利用化学发光信号或比色信号检测酶开关的激活，并对引物DNA进行定量检测(图1)。
[0011]本方法能够利用滚环扩增诱导酶开关激活的原理：
[0012]本专利技术以HRP
‑
Cu
2+
为酶开关，是因为首先Cu
2+
能跟HRP络合并很好的抑制HRP的活性，其次，Cu
2+
也能跟PPi络合且PPi对Cu
2+
的络合作用强于HRP对Cu
2+
络合作用，所以在HRP
‑
Cu
2+
溶液中加入PPi后，HRP
‑
Cu
2+
中的Cu
2+
能被PPi络合离去，使得HRP恢复活性，实现酶开关的激活(图2)；另外，在滚环扩增中，通过聚合酶phi29催化dNTPs不断的在环状模板上进行互补链的组装，在短时间内能够生成包含成千上万个碱基的长链DNA，而每个dNTP生成碱基的反应会产生一个PPi，所以伴随滚环扩增过程会有大量的PPi生成(图3)；因此，联合上述酶开关的PPi激活和PPi的滚环扩增式生成，本专利技术提出了一种滚环扩增诱导酶开关激活的方法。
[0013]本专利技术与现有技术相比，具有以下特点：
[0014]本专利技术通过Cu
2+
与HRP和PPi络合作用的强弱设计酶开关激活策略，联合PPi的滚环扩增式生成，发展了一种滚环扩增诱导酶开关激活的方法，相比于现有基于HRP发展的信号方法，具有以下特点：
[0015](1)基于HRP催化活性的抑制和恢复，设计酶开关激活策略，为发展简单、高效的信号开关方法提供新思路；
[0016](2)利用滚环扩增过程中生成的PPi作为酶开关激活剂，该酶开关激活方法能广泛应用于生物分子的均相检测；
[0017](3)由于PPi伴随滚环扩增中每个碱基的生成，该酶开关激活方法具有很好的信号放大性质，对发展高灵敏的生物检测方法具有重要意义。
四、附图说明
[0018]图1.滚环扩增诱导酶活性激活示意图
[0019]图2.酶开关的设计和激活示意图
[0020]图3.PPi的滚环扩增式生成示意图
五、具体实施方式
[0021]实施例1：滚环扩增诱导酶开关激活的方法用于引物DNA的化学发光检测：
[0022]20μL滚环扩增溶液(包含不同浓度的引物DNA和一定浓度的模板DNA、核酸连接酶
SplintR、dNTPs及聚合酶phi29)在37℃反应1个小时，然本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种滚环扩增诱导酶开关激活的方法，其特征在于以被二价铜离子(Cu
2+
)抑制了催化活性的辣根过氧化物酶(HRP)为酶开关(HRP
‑
Cu
2+
)，以核酸滚环扩增中产生的焦磷酸根离子(PPi)为激活剂，基于PPi对Cu
2+
强的络合作用，HRP
‑
Cu
2+
中的Cu
2+
被PPi络合离去，从而恢复HRP的活性，完成酶开关的激活，激活后的酶开关可联合HRP催化反应，产生比色、化学发光等信号，该方法可用于能诱发滚环扩增反应的靶标分子的高灵敏检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的H...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠熀先，吴洁，敖航，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：