一种重组酶介导核酸恒温扩增反应系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种重组酶介导核酸恒温扩增反应系统及其应用，涉及核酸恒温扩增技术领域，包括的原料分别为Tris缓冲液、乙酸钾、乙酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、肌酸激酶、海藻糖、甜菜碱、T4gp32蛋白、T4UvsX重组酶、T4UvsY辅助蛋白、Bsu DNA聚合酶、核酸外切酶、正向引物、反向引物和荧光探针。本发明专利技术还提供了一种恒温核酸扩增的应用，除了常规应用以外，还可将上述反应系统与NanoSPR生物芯片进行联用，能提高灵敏度10

【技术实现步骤摘要】
一种重组酶介导核酸恒温扩增反应系统及其应用


[0001]本专利技术涉及核酸恒温扩增
，特别涉及一种重组酶介导核酸恒温扩增反应系统及其应用。

技术介绍

[0002]常规的单重和多重PCR技术由于热循环的特殊条件要求，需要依赖于昂贵的PCR仪器，限制了这一技术在实验室之外的广泛应用。恒温核酸扩增技术正好解决的上述问题的限制，是一个不可逆转的趋势。在过去的十年当中，一些恒温核酸扩增技术，例如TMA技术(转录介导的核酸扩增技术)、SDA技术(链置换核酸扩增技术)、LAMP(环介导核酸扩增技术)、HAD(解旋酶依赖等温核酸扩增技术)等，得到快速发展，都可以用于DNA在等温条件下扩增。这些技术只需要一个相对较低温且恒定的反应温度(60
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65℃)就可以实现高效的核酸扩增，使整个反应摆脱对精密温度循环控制的PCR仪的依赖。然而这一技术仍然需要温度控制装置来保持60
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65℃的反应温度，这同样限制了恒温核酸扩增技术的广泛应用。
[0003]重组酶介导核酸恒温扩增技术(Recombinase
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Aid Amplification，RAA)技术是在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术。RAA法利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶代替了传统PCR的热循环解链过程，实现了在37℃恒温下的核酸快速扩增，有望在不远的将来取代传统的热循环PCR反应。现有技术中，中国专利申请CN110387405A提供了一种快速检测核酸的(RT)RAA
‑/>CRISPR系统，该系统包括常温恒温扩增系统和CRISPR检测系统，常温恒温扩增系统又包括核酸扩增系统和RNA转录系统；核酸扩增系统包括逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、辅助蛋白、恒温常温扩增系统化学试剂和RAA引物组；重组酶来源于大肠杆菌的RecA或T4噬菌体重组酶uvsX；单链结合蛋白源于E.coli或T4的GP32蛋白；辅助蛋白的序列可选自T4噬菌体的uvsY蛋白；DNA聚合酶的序列可源于E.coli的DNA聚合酶IKlenow大片段、Bst聚合酶、Phi
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29聚合酶或枯草芽孢杆菌Po1I(Bsu)；重组酶恒温扩增系统化学试剂包括Tris、RNase抑制剂、dNTPs、rNTP、磷酸肌酸二钠盐、乙酸钾、海藻糖、甘露醇、聚乙二醇、二硫苏糖醇、PCR引物、引导RNA和taqman探针，还公开了。然而，这种恒温常温扩增系统化学试剂灵敏度有限，检测下限为10^4copies以上，对于某些低浓度病毒样本，无法像常规热循环PCR方法那样进行接近单分子级别的高灵敏度检测。
[0004]纳米等离子体共振(NanoSPR)检测技术，是在纳米等离子体共振生物芯片上制作出直径不超过500nm的纳米孔阵列，通过入射光与金属纳米孔结构的共振耦合，利用表面等离子体共振的波长对于纳米结构周围介电环境的敏感性，实现对生化反应的检测。当吸附分子的折射率与周围环境的折射率存在差异时，吸附于基底表面的生物分子与目标分子的反应会改变基底表面的折射率，从而引起共振峰的变化，实现目标待测物质的检测。因此，纳米表面等离子体传感器的共振分析过程无需使用传统SPR技术那样的复杂光学系统。将NanoSPR技术应用于RAA技术中具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0005]针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了一种重组酶介导核酸恒温扩增反应系统及其应用，利用了Bsu DNA聚合酶在另外几个带有复制蛋白的重组酶蛋白存在的条件下，能将新生成的核酸单链从新合成的DNA双链上置换下来的机理，在常温(37
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42℃)下实现对特定核酸序列进行高效指数级扩增，10min实现104倍的扩增。这使得核酸扩增的过程对仪器的要求降到最低，不需要进行传统的热循环。与传统的RAA反应不同的是，本专利技术提供的反应试剂中，高浓度的高分子量的聚乙二醇和甘油作为拥挤剂，刺激关键蛋白与DNA的相互作用，大大提高荧光值。试剂以冻干粉的形式运输保存，促进了它们在疾病快速诊断，炎症因子和肿瘤标志物筛查等技术中的应用。具体通过以下技术实现。
[0006]一种重组酶介导核酸恒温扩增反应系统，包括的原料和相应的浓度分别为50
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200mM Tris缓冲液、50
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200mM乙酸钾、5
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30mM乙酸镁、5
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30mM二硫苏糖醇、5
‑
20wt％聚乙二醇、1
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15mM ATP、0.2
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3mM dNTPs、20
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100mM磷酸肌酸、20
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200μg/L肌酸激酶、10
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200mg/L海藻糖、1
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10wt％甜菜碱、500
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1500mg/L T4gp32蛋白、50
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300mg/L T4UvsX重组酶、10
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100mg/L T4UvsY辅助蛋白、1
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5U核酸外切酶、5
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100mg/L Bsu DNA聚合酶，还包括正向引物、反向引物和荧光探针，且每种引物或荧光探针的浓度为150
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600nM；所述正向引物、反向引物为未经修饰的正向引物和未经修饰的反向引物，或为氨基化正向引物和氨基化反向引物，或为巯基化正向引物和巯基化反向引物。
[0007]本专利技术提供的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统中，RAA由2个关键蛋白(T4UvsX重组酶和单链DNA结合蛋白gp32)组成。复制是由具有链置换活性所需的Bsu DNA聚合酶完成的。
[0008]聚乙二醇作为拥挤剂刺激RAA关键蛋白与DNA的相互作用。
[0009]T4 UvsX重组酶是具有配对和链转移活性的重组酶，在反应体系中与引物结合形成引物
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蛋白复合体，携带引物对DNA模板进行扫描识别与结合，当引物识别到同源序列后即可发生链置换反应，以替代PCR反应中热变性步骤。
[0010]T4 UvsY蛋白是重组酶的辅助蛋白，增强T4 UvsX的单链DNA依赖ATPase活性并降低活性所需的T4 UvsX临界浓度。
[0011]T4 gp32蛋白是一种单链结合蛋白，参与DNA复制、修复、重组，与解链后的ssDNA结合，防止自杂交。
[0012]Bsu DNA聚合酶的作用是，使引物与模板结合发生链置换反应，对模板上的扩增目标区域进行指数扩增。
[0013]dNTPs包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP，是DNA聚合酶用来合成新模板的构件。
[0014]PEG和甘油作为拥挤试剂可以增强酶的活性，刺激RAA关键蛋白与DNA的相互作用，很好的模拟了体内真实的生物大分子条件并促进了扩增。
[0015]DTT是一种消除游离巯基的稳定酶；
[0016]ATP、磷酸肌酸和肌酸激酶这三种成分构成了重组酶和DNA聚合酶活动的能量供应系本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组酶介导核酸恒温扩增反应系统，其特征在于，包括的原料和相应的浓度分别为50
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200mM Tris缓冲液、50
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200mM乙酸钾、5
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30mM乙酸镁、5
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30mM二硫苏糖醇、5
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20wt％聚乙二醇、1
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15mM ATP、0.2
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3mM dNTPs、20
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100mM磷酸肌酸、20
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200μg/L肌酸激酶、10
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200mg/L海藻糖、1
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10wt％甜菜碱、500
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1500mg/L T4gp32蛋白、50
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300mg/L T4UvsX重组酶、10
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100mg/L T4UvsY辅助蛋白、1
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5U核酸外切酶、5
‑
100mg/L Bsu DNA聚合酶，还包括正向引物、反向引物和荧光探针，且每种引物或荧光探针的浓度为150
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600nM；所述正向引物、反向引物为未经修饰的正向引物和未经修饰的反向引物，或为氨基化的正向引物和氨基化反向引物，或为巯基化的正向引物和巯基化反向引物。2.根据权利要求1所述的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统，其特征在于，包括的原料和相应的浓度分别为50mM Tris缓冲液、100mM乙酸钾、15mM乙酸镁、5mM二硫苏糖醇、8wt％聚乙二醇、3mM ATP、0.5mM dNTPs、50mM磷酸肌酸、80μg/L肌酸激酶、150mg/L海藻糖、2wt％甜菜碱、500mg/L T4gp32蛋白、350mg/L T4UvsX重组酶、55mg/L T4UvsY辅助蛋白、90mg/L Bsu DNA聚合酶、5U核酸外切酶；还包括引物组合，且所述正向引物的浓度为400nM，所述反向引物的浓度为400nM，荧光探针的浓度为120nM。3.根据权利要求1所述的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1所述的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统，其特征在于，所述荧光探针是在如SEQ ID NO.3所示的序列上设计四个修饰位...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄丽萍，陈友倩，何佳俊，刘钢，
申请(专利权)人：量准武汉生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：