测量样品的pH的方法技术

本发明专利技术提供了一种更灵敏和更准确的监测溶液的pH的方法，其中溶液的pH被定量为两电极或三电极电化学电池中溶液的电化学反应的函数，其中所述溶液包含其氧化态和/或结构构象能够随溶液pH的变化而变化的化合物。本发明专利技术还提供了能够对样品例如生物样品中的特定多核苷酸序列进行分析的高加速方法和过程。本发明专利技术的方法例如可用于在即时情况下对大量样品进行快速筛选。行快速筛选。行快速筛选。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】测量样品的pH的方法


[0001]本专利技术提供了一种更灵敏和更准确的监测溶液的pH的方法，其中溶液的pH被定量为两电极或三电极电化学电池中溶液的电化学反应的函数，其中所述溶液包含其氧化态和/或结构构象能够随溶液pH的变化而变化的化合物。
[0002]本专利技术还提供了能够对样品例如生物样品中的特定多核苷酸序列进行分析的高加速方法和过程。本专利技术的方法例如可用于在即时(point
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of
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care)情况下对大量样品进行快速筛选。
[0003]专利技术背景
[0004]核酸扩增方法对于医学和环境诊断至关重要，通常被认为是多种诊断应用中的黄金标准。聚合酶链反应、定量聚合酶链反应、逆转录酶聚合酶链反应和定量逆转录酶聚合酶链反应等传统方法在很大程度上依赖于热循环来驱动扩增，因为常用的聚合酶需要不同的温度进行变性、退火和延伸。这些方法的技术问题和由此产生的高实施成本阻碍了它们的即时使用。等温扩增方法如分支滚环扩增(Branched Rolling Circle Amplification)和环介导等温扩增是替代方法。
[0005]核酸扩增子的定量和扩增的实时监测是间接的并且需要标记，这对于扩增反应来说不是必需的。这些可以包括与寡核苷酸或引物连接的荧光染料或发色团，DNA嵌入染料，沟槽结合剂(groove binder)，与核苷酸、磷酸基团、核糖或脱氧核糖基团以及核酸内源性的氮碱基结合的染料。这些染料或复合物可在与DNA结合时表现出光谱偏移，当被合适波长的光激发时经历荧光共振能量转移和/或荧光量级的变化，从而促进光学检测。这种定量方法需要昂贵且灵敏的光学器件，从而进一步限制了分子诊断在即时应用中的使用。
[0006]这些DNA结合分子中的一些，例如Hoechst 33258、亚甲蓝、核酸结合过渡金属复合物，例如含钌、锇或铂的复合物，也具有电活性，并且可以通过将所述分子与成功扩增时新生成的扩增子连续隔离以及随后降低的反应混合物的电导率来促进间接电化学检测。
[0007]另外的电化学检测方法包括将酶、引物或探针寡核苷酸固定在电极表面，从而驱动对扩增子或副产物的定量。这些方法中的大多数要么是间接的，要么需要昂贵的设备。
[0008]环介导等温扩增技术的最新发展包括在弱缓冲反应混合物中比色检测RNA和DNA靶标，这是由pH敏感的染料介导的(WO 2017/209920、WO 2014/031783)。由于低浓度Tris导致的弱缓冲被扩增过程中释放的质子克服，并导致通过pH指示剂颜色变化指示的终点检测。所述方法已被推行用于即时检测，但遇到反应时间长、对低核酸浓度灵敏度低以及需要昂贵的光学设备进行定量的问题。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供了一种更灵敏和更准确的监测溶液的pH的方法，其中溶液的pH被定量为三电极电化学电池中溶液的电化学反应的函数，其中溶液包含醌、醌衍生物和/或pH指示剂。已发现这种更灵敏和更准确的方法在确定样品中是否存在靶多核苷酸时，以及还在定量样品中存在的靶多核苷酸时提供快速和准确的结果。
[0010]因此，本专利技术还提供了一种对样品中的靶多核苷酸进行定量的方法。所述方法可以以高灵敏度进行，无需光学设备进行定量，并且反应时间短。特别地，可以从电化学电池例如三电极电化学电池的电化学反应(例如，电流和/或电势和/或阻抗)的变化速率推导出靶多核苷酸的定量。
[0011]因此，本专利技术提供了能够对样品中的特定多核苷酸序列进行分析的高加速方法和过程。这些方法确实可用于在即时情况下对大量样本进行快速筛选。
[0012]这之所以成为可能，是因为对核酸扩增技术(例如LAMP)与使用电化学电池(例如，三电极电化学电池或具有多个膜电极(film electrode)的电化学电池)对信号传导物质进行电化学定量相结合的创造性探索。
[0013]本专利技术在所附权利要求中定义。
[0014]根据本专利技术的第一个方面，提供了一种测量溶液的pH的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0015]‑
提供包含醌、醌衍生物和/或pH指示剂的溶液；
[0016]‑
将溶液应用于三电极电化学电池；
[0017]‑
测量电化学电池的电化学反应；和
[0018]‑
将溶液的pH定量为电化学电池的电化学反应的函数。
[0019]根据本专利技术的另一个方面，提供了三电极电化学电池用于测量溶液的pH的用途，所述用途包括：
[0020]‑
提供包含醌、醌衍生物、pH指示剂或其组合的溶液；
[0021]‑
将溶液应用于三电极电化学电池；
[0022]‑
测量电化学电池的电化学反应；和
[0023]‑
将溶液的pH定量为电化学电池的电化学反应的函数。
[0024]根据本专利技术的另一个方面，提供了三电极电化学电池用于监测核酸扩增反应的用途，所述用途包括：
[0025]‑
提供包含醌、醌衍生物、pH指示剂或其组合的溶液；
[0026]‑
提供LAMP混合物，其包含：包含靶多核苷酸的样品，至少两种例如至少四种引物，每种引物侧翼是靶多核苷酸，和LAMP试剂；
[0027]‑
将溶液和LAMP混合物应用于三电极电化学电池；
[0028]‑
测量电化学电池的电化学反应；和
[0029]‑
将溶液的pH定量为电化学电池的电化学反应的函数。
[0030]根据本专利技术的另一个方面，提供了用于测量溶液的pH的系统，所述系统包含：
[0031]a.包括恒电势仪(potentiostat)的仪器；和
[0032]i.包含三电极电化学电池的第一接受器和包含醌、醌衍生物和/或pH指示剂的第二接受器，或
[0033]ii.包含三电极电化学电池和醌、醌衍生物和/或pH指示剂的第一接受器，
[0034]其中恒电势仪被配置为测量电化学电池的电化学反应。
附图说明
[0035]图1：LAMP引物及其退火的多核苷酸序列的示意图。箭头表示引物退火的位置，不
同的灰色阴影表示互补性。FIP：正向内引物。BIP：反向内引物。F3：正向外引物。B3：反向外引物。FL：正向环引物。BL：反向环引物。
[0036]图2：(A)将在经过适当处理(如果有的话)后的合适的载体或运输介质(如果有的话)中的流体或流体化或重悬的生物样品与(B)LAMP引物和(C)来自New England Biolabs Inc的WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix混合，并立即添加到(D)pH传感丝网印刷电极或丝网印刷电极，该电极在59
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75℃下并与恒电势仪连接，并使伏安法或其他电化学测量运行1至90分钟。测量(E)信号随时间的变化。与平行化或预校准的非模板对照相比1至90分钟内的信号零变化，表明(F)不存在模板核酸。信号的显著本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种测量溶液的pH的方法，其中所述方法包括以下步骤：
‑
提供包含醌、醌衍生物和/或pH指示剂的溶液；
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将所述溶液应用于三电极电化学电池；
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测量电化学电池的电化学反应；和
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将所述溶液的pH定量为电化学电池的电化学反应的函数。2.根据权利要求1所述的方法，其中醌或醌衍生物选自1,2
‑
苯醌、1,4
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苯醌、1,4
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萘醌、9,10
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蒽醌，以及它们的衍生物和组合。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述pH指示剂选自孔雀石绿草酸盐、亮绿、黄色曙红、赤藓红B、甲基绿、甲基紫、苦味酸、甲酚红、结晶紫、间甲酚紫、百里酚蓝、对二甲酚蓝、(蓝色)曙红、喹哪啶红、2,4
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二硝基苯酚、4
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(二甲基氨基)偶氮苯、溴氯酚蓝、溴酚蓝、刚果红、甲基橙、溴甲酚绿、2,5
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二硝基苯酚、茜素磺酸、甲基红、氯酚红、石蕊、溴甲酚紫、溴酚红、4
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硝基苯酚、溴二甲酚蓝、溴百里酚蓝、酚红、3
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硝基苯酚、中性红、甲酚红、1
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萘酚酞、间甲酚紫、百里酚蓝、对二甲酚蓝、酚酞、百里酚酞、碱性蓝、茜素黄GG、靛洋红、依波西隆蓝、达旦黄，及它们的组合。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将醌、醌衍生物和/或pH指示剂溶解在所述溶液中。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所测量的电化学电池的电化学反应是电化学电池的电势、电化学电池的电流、电化学电池的阻抗，或这些的组合。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所测量的电化学电池的电化学反应包括电化学电池的电势、电化学电池的电流、电化学电池的阻抗的组合。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中电化学电池的电势通过循环方波伏安法、方波伏安法、线性扫描伏安法、循环伏安法或开路电势法进行测量。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述溶液内的醌、醌衍生物和/或pH指示剂的浓度为约1μM至约1000μM，例如约1μM至约500μM，例如约5μM至约250μM，尤其是约50μM至约200μM。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述溶液的pH定量为电化学电池的电化学反应的步骤是通过应用回归算法来进行的。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述溶液包含缓冲剂。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述溶液进一步包含样品，优选地其中所述样品选自鼻样品、咽喉样品、肛门样品、阴道样品、耳排出物样品、皮肤表面拭子样品、尿液样品、全血样品、血清样品、血浆样品和淋巴引流样品。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述溶液进一步包含引物和核酸扩增试剂，优选地其中所述核酸扩增试剂是LAMP试剂。13.根据权利要求8所述的方法，其中，所述核酸扩增试剂包含信号传导物质，或能够释放信号传导物质，或包含信号传导物质和能够释放信号传导物质的物质这两者。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述信号传导物质是H
+
。15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述方法包括进行核酸扩增步骤优选多个核酸扩增步骤的步骤。16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述一个或多个核酸扩增步骤是
环介导等温扩增(LAMP)步骤。17.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其中所述方法用于确定所述溶液中靶多核苷酸的存在。18.根据权利要求12至17中任一项所述的方法，其中测量电化学电池的电化学反应的步骤包括测量由于所述信号传导物质浓度变化而导致的电化学电池的电流和/或电势的变化。19.根据权利要求12至18中任一项所述的方法，其中所述LAMP试剂包括逆转录酶。20.根据权利要求12至19中任一项所述的方法，其中所述引物包括正向内引物、反向内引物、正向外引物和反向外引物。21.根据权利要求20所述的方法，任选地其中使用另外一对环引物，例如正向环引物和/或反向环引物来进行LAMP扩增。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述三电极电化学电池包含工作电极、参比电极和对电极。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述工作电极包含离子选择性膜，对其定位以使所述溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：戴格纳生物公司，
类型：发明
国别省市：