一种变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法，该方法包括硫代磷酸化外引物、硫代磷酸化双链内引物、线性引物、核苷酸聚合酶、核酸嵌合染料、目标核酸序列、变性剂尿素，所述变性剂尿素可辅助引物退火和延伸产物自匹配，所述硫代磷酸化序列由硫代磷酸化核苷酸组成且可发生自匹配，所述硫代磷酸化双链内引物其内部为硫代磷酸化双链结构、两侧为可识别目标核酸序列的单链结构，所述硫代磷酸化外引物序列、硫代磷酸化双链内引物的两侧单链序列能与内外巢式分布的目标核酸序列位点特异性结合并被延伸。本发明专利技术方法在低温条件下利用核酸嵌入染料即可实现高特异性核酸扩增检测，有望降低便携式等温核酸检测装置的设计难度和能量消耗。和能量消耗。和能量消耗。

【技术实现步骤摘要】
一种变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体的是变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法。

技术介绍

[0002]核酸扩增检测技术作为一种高灵敏分子诊断技术能够检测痕量与疾病相关核酸，已广泛应用于病原体检测、临床诊断等。较之其他分子诊断技术如抗原、抗体检测等，核酸扩增检测技术在时效和性能上更具优势，尤其是以聚合酶链式反应(PCR)为核心的核酸扩增检测技术。然而基于PCR的核酸扩增方法严重依赖于温度的热循环，难以满足当前疾病防控对现场检测和面向家庭使用的迫切需求。因此，等温核酸扩增方法伴随PCR技术悄然兴起并不断向前发展。相比PCR方法而言，等温核酸扩增方法无须热循环，在恒温条件下即可实现对目标核酸的高效扩增。另外，在检测速度、检测性能以及可视化检测方面，等温核酸扩增方法具备现场检测和面向家庭使用的应用潜力。
[0003]目前，等温核酸扩增方法主要分为两大类，即多引物等温扩增和多酶等温扩增。多引物等温扩增方法采用至少两对引物识别至少四个目标位点，在链置换核苷酸聚合酶作用下实现对DNA目标的指数扩增，例如环介导等温扩增(Loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)、交叉引物扩增(Crossing Priming Amplification，CPA)、等温多自配引发扩增(Isothermal Multiple Self
‑
matching
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initiated amplification，IMSA)和双促发等温扩增(Dual
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Priming Isothermal Amplification，DAMP)；多酶等温扩增方法则通过至少两种功能性酶的协同作用，在一对引物的参与下完成对DNA目标的指数扩增，例如重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)、解旋酶依赖型扩增(Helicase
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dependent amplification，HDA)、链置换扩增(Strand Displacement Amplification,SDA)和滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)。
[0004]多引物等温扩增方法如LAMP法需要高的反应温度，其适宜范围在60
‑
65℃。这一局限性导致在开发多引物等温扩增便携式检测设备时需要考虑温度稳定性和能量消耗，设计难度较大。多引物等温扩增的热启动性也限制其应用范围，如难以用于37℃条件下细胞或组织切片的原位分子检测。此外，在建立基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片的数字等温扩增检测方法方面，由于PDMS气透性，长时间高反应温度易引起反应液水分的蒸发，导致微量反应体系变小甚至变干，影响数字定量的准确性。多酶等温扩增如RPA法虽然能在低温条件如37℃下进行扩增反应，但其高效性能需要添加拥挤试剂如Carbowax20M和聚乙二醇(PEG)，导致体系粘稠度变大，不利于试剂成分分散，影响痕量分子的检测能力。另外，多酶等温扩增方法如RPA和SDA法具有很强的非特异性扩增现象，无法利用便宜的核酸嵌入染料如SYBR Green和EvaGreen实现特异性扩增检测，不得不选择高成本的核酸探针和二次产物分析如侧向流动试纸分析。因此，亟需开发能在低温条件如37℃下利用核酸嵌入染料即可实现高特异性核酸扩增检测的多引物等温核酸扩增新方法，有望降低便携式等温核酸检测装置的设计难度和能量消耗。

技术实现思路

[0005]为解决上述
技术介绍
中提到的不足，本专利技术的目的在于提供一种变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法，该方法能在低温条件如37℃下利用核酸嵌入染料实现高特异性核酸扩增检测，解决了当前多引物等温核酸扩增无法在低温条件下实现高效扩增的技术问题，具备降低便携式等温核酸检测装置的设计难度和能量消耗的潜力。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0007]一种变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法，包括变性剂尿素解链辅助引物退火和延伸产物自匹配、硫代磷酸化序列自匹配、指数循环扩增，其特征在于，所述等温核酸扩增方法所采用的试剂包含硫代磷酸化上游外引物、硫代磷酸化下游外引物、硫代磷酸化双链内引物、上游线性引物、下游线性引物、具有链置换活性的核苷酸聚合酶、核酸嵌合染料、目标核酸序列、变性剂尿素，所述硫代磷酸化上游或下游外引物是由两个目标核酸序列位点组合而成的单链，所述两个位点分别作为引物的5
′
端和3
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端序列，所述5
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端引物序列核苷酸均为硫代磷酸化修饰，所述硫代磷酸化双链内引物是由四个目标核酸序列位点组成的、内双链
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外单链的复合体，所述内双链结构是由两个完全互补的、均被硫代磷酸化修饰的位点配对形成，所述外单链结构是指复合体两侧均含能与目标核酸序列识别并被延伸的单链；所述上游或下游线性引物是由单个目标核酸序列位点组成。
[0008]上述等温核酸扩增方法是在现有多引物等温扩增技术的基础上做的新引物设计以及新体系构建，该方法的完整反应体系主要包括以下组分：硫代磷酸化上游外引物、硫代磷酸化下游外引物、硫代磷酸化双链内引物、上游线性引物、下游线性引物、具有链置换活性的核苷酸聚合酶、核酸嵌合染料、目标核酸序列、变性剂尿素、反应缓冲液、dNTPs和镁离子。
[0009]该方法的具体反应原理，如下：
[0010]a)在变性剂尿素辅助目标核酸序列解链下，上下游线性引物分别与目标核酸序列位点特异性结合，在核苷酸聚合酶作用下，以目标序列为模板，沿着目标序列5
′
端进行延伸，延伸产物将进一步打开目标核酸序列，暴露出其他引物的识别位点；
[0011]b)硫代磷酸化上下游外引物和硫代磷酸化双链内引物分别与各自的目标核酸序列位点特异性结合，在核苷酸聚合酶作用下，以目标序列为模板，沿着目标序列5
′
端进行延伸，延伸产物与目标序列形成双链或被置换形成一端含双链结构的单链；
[0012]c)所述b)中双链延伸产物在变性剂尿素解链辅助下会发生硫代磷酸化序列自匹配，继而再次暴露目标序列位点，被对应硫代磷酸化引物识别后介导循环扩增；
[0013]d)所有引物以b)中所述单链延伸产物为模板，在核苷酸聚合酶作用下进入以5
′
端硫代磷酸化序列自匹配成环、3
′
端序列自匹配成环并延伸、引物识别环上序列并延伸为主要步骤的指数循环扩增阶段。
[0014]上述硫代磷酸化上游外引物序列、硫代磷酸化下游外引物序列、硫代磷酸化双链内引物的两侧单链序列均与目标核酸序列特异性结合，所结合的位点呈内外巢式分布。
[0015]上述硫代磷酸化上外引物或下游外引物均包含两个目标位点，分别构成引物的5
′
端和3
′
端序列，其中5
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端序列为硫代本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法，其特征在于，包括变性剂尿素解链辅助引物退火和延伸产物自匹配、硫代磷酸化序列自匹配、指数循环扩增，其特征在于，所述等温核酸扩增方法所采用的试剂包含硫代磷酸化上游外引物、硫代磷酸化下游外引物、硫代磷酸化双链内引物、上游线性引物、下游线性引物、具有链置换活性的核苷酸聚合酶、核酸嵌合染料、目标核酸序列、变性剂尿素，所述硫代磷酸化上和下游外引物是由两个目标核酸序列位点组合而成的单链，所述两个位点分别作为引物的5
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端和3
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端序列，所述5
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端引物序列核苷酸均为硫代磷酸化修饰，所述硫代磷酸化双链内引物是由四个目标核酸序列位点组成的、内双链
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外单链的复合体，所述内双链结构是由两个完全互补的、均被硫代磷酸化修饰的位点配对形成，所述外单链结构是指复合体两侧均含能与目标核酸序列识别并被延伸的单链；所述上和下游线性引物是由单个目标核酸序列位点组成；所述等温核酸扩增的过程，包括：a)在变性剂尿素辅助目标核酸序列解链下，上下游线性引物分别与目标核酸序列位点特异性结合，在核苷酸聚合酶作用下，以目标序列为模板，沿着目标序列5
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端进行延伸，延伸产物将进一步打开目标核酸序列，暴露出其他引物的识别位点；b)硫代磷酸化上下游外引物和硫代磷酸化双链内引物分别与各自的目标核酸序列位点特异性结合，在核苷酸聚合酶作用下，以目标序列为模板，沿着目标序列5
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端进行延伸，延伸产物与目标序列形成双链或被置换形成一端含双链结构的单链；c)所述b)中双链延伸产物形在变性剂尿素解链辅助下会发生硫代磷酸化序列自匹配，继而再次暴露目标序列位点，被对应硫代磷酸化引物识别后介导循环扩增；d)所有引物以b)中所述单链延伸产物为模板，在核苷酸聚合酶作用下进入以5
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端硫代磷酸化序列自匹配成环、3
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端序列自匹配成环并延伸、引物识别环上序列并延伸为主要步骤的指数循环扩增阶段。2.根据权利要求1所述的变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法，其特征在于，所述硫代磷酸化上游外引物序列、硫代磷酸化下游外引物序列、硫代磷酸化双链内引物的两侧单链序列均与目标核酸序列特异性结合，所结合的位点呈内外巢式分布。3.根据权利要求1所述的变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法，其特征在于，所述硫代磷酸化上游外引物和下游外引物均包含两个目标位点，分别构成引物的5
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端和3
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端序列，其中5
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端序列为硫代磷酸化核苷酸。4.根据权利要求1所述的变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法，其特征在于，所述硫代磷酸化双链内引物包含四个目标位点，共同构成内部双链、两侧单链的二元...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁雄，王雅茹，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：