检测单链RNA病毒的方法技术

本发明专利技术的一个方式的检测试样中的单链RNA病毒的方法包括使引物组与试样接触而进行逆转录环介导等温扩增反应的步骤，引物组基于靶RNA的碱基序列和与靶RNA互补的核酸的碱基序列来设计，并且包含以下(i)～(v)：(i)FIP引物；(ii)BIP引物；(iii)作为外引物的F3引物；(iv)作为外引物的B3引物；和(v)一种以上额外的外引物，各额外的外引物具有与在与靶RNA互补的核酸中比区域B3或区域F3更靠近5

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测单链RNA病毒的方法


[0001]本专利技术涉及检测单链RNA病毒的方法。

技术介绍

[0002]病毒是寄生于细胞的生物，不能单独培养病毒，因此，作为在病毒感染症的诊断中在短时间内确定致病病毒的方法，主要利用基因诊断。在病毒的基因诊断中，通过核酸扩增反应扩增作为检测对象的病毒所固有的核酸序列并进行检测。
[0003]作为核酸扩增法的一种，已知环介导等温扩增(LAMP(Loop
‑
Mediated Isothermal Amplification))法(专利文献1)。在该方法中，基于靶核酸的6个区域(F3、F2、F1、B1c、B2c和B3c或者F3c、F2c、F1c、B1、B2和B3)来设计两种内引物(FIP引物和BIP引物)和两种外引物(F3引物和B3引物)，使用这些引物在恒定温度下扩增靶核酸。另外，已知在LAMP法中，除了上述内引物和外引物以外，还使用两种环引物(环引物F和环引物B)，由此使扩增反应的效率提高(专利文献2)。
[0004]病毒根据基因组的核酸种类而分类为双链DNA病毒、单链RNA病毒等。单链RNA病毒分为基因在从5
’
末端到3
’
末端的方向上被读取的+链(正链)病毒和基因通过互补链在从3
’
末端到5
’
末端的方向上被读取的
‑
链(负链)病毒。在扩增RNA病毒的核酸的情况下，在扩增反应开始时，需要使用逆转录酶从模板RNA合成cDNA的逆转录反应。与逆转录反应组合的LAMP法被称为逆转录环介导等温扩增(RT
‑
LAMP)法(例如专利文献3)。
[0005]现有技术文献
[0006]专利文献
[0007]专利文献1：国际公开第00/28082号
[0008]专利文献2：国际公开第02/24902号
[0009]专利文献3：国际公开第2018/042598号

技术实现思路

[0010]专利技术所要解决的问题
[0011]根据专利文献1～3中记载的LAMP法，虽然能够以比较高的灵敏度检测病毒，但由于在病毒性疾病中存在很多带来严重症状的疾病，因此需要更可靠地检测成为这些疾病的原因的病毒的方法。因此，本专利技术的目的在于以高灵敏度检测单链RNA病毒。
[0012]用于解决问题的方法
[0013]本专利技术人进行了深入研究，结果发现，除了以往的6种引物以外，还使用特定的额外的外引物进行RT
‑
LAMP反应，由此能够以更高的灵敏度检测单链RNA病毒，从而完成了本专利技术。根据本专利技术人的新见解，即使追加对与单链RNA病毒的靶RNA互补的核酸的3
’
末端侧的区域进行退火的外引物，检测的灵敏度也不提高，与此相对，追加对单链RNA病毒的靶RNA的3
’
末端侧的区域进行退火的外引物时，检测的灵敏度提高。
[0014]本专利技术涉及以下[1]～[8]。
[0015][1][0016]一种检测试样中的单链RNA病毒的方法，其包括使引物组与试样接触而进行逆转录环介导等温扩增反应的步骤，
[0017]引物组基于单链RNA病毒的靶RNA的碱基序列和与该靶RNA互补的核酸的碱基序列来设计，
[0018]在单链RNA病毒为正链单链RNA病毒的情况下，靶RNA在从5
’
末端到3
’
末端的方向上依次具有任选的区域F3、F2、F1、B1c、B2c和B3c，与靶RNA互补的核酸在从3
’
末端到5
’
末端的方向上依次具有任选的区域F3c、F2c、F1c、B1、B2和B3，
[0019]在单链RNA病毒为负链单链RNA病毒的情况下，靶RNA在从3
’
末端到5
’
末端的方向上依次具有任选的区域F3c、F2c、F1c、B1、B2和B3，与靶RNA互补的核酸在从5
’
末端到3
’
末端的方向上依次具有任选的区域F3、F2、F1、B1c、B2c和B3c，
[0020]引物组包含以下(i)～(v)：
[0021](i)在5
’
末端具有与区域F1c相同的碱基序列且在3
’
末端具有与区域F2相同的碱基序列的FIP引物；
[0022](ii)在5
’
末端具有与区域B1c相同的碱基序列且在3
’
末端具有与区域B2相同的碱基序列的BIP引物；
[0023](iii)具有与区域F3相同的碱基序列的、作为外引物的F3引物；
[0024](iv)具有与区域B3相同的碱基序列的、作为外引物的B3引物；和
[0025](v)一种以上额外的外引物，各额外的外引物具有与在与靶RNA互补的核酸中比区域B3或区域F3更靠近5
’
末端侧处存在的任选的区域相同的碱基序列，
[0026]其中，FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物和一种以上额外的外引物的碱基序列中可能存在的尿嘧啶可以被置换为胸腺嘧啶。
[0027][2][0028]一种检测试样中的正链检测单链RNA病毒的方法，其包括使引物组与试样接触而进行逆转录环介导等温扩增反应的步骤，
[0029]引物组基于靶RNA的碱基序列和与靶RNA互补的核酸的碱基序列来设计，
[0030]所述靶RNA的碱基序列在从5
’
末端到3
’
末端的方向上依次具有任选的区域F3、F2、F1、B1c、B2c和B3c，
[0031]所述与靶RNA互补的核酸的碱基序列在从3
’
末端到5
’
末端的方向上依次具有任选的区域F3c、F2c、F1c、B1、B2和B3，
[0032]引物组包含以下(i)～(v)：
[0033](i)在5
’
末端具有与区域F1c相同的碱基序列且在3
’
末端具有与区域F2相同的碱基序列的FIP引物；
[0034](ii)在5
’
末端具有与区域B1c相同的碱基序列且在3
’
末端具有与区域B2相同的碱基序列的BIP引物；
[0035](iii)具有与区域F3相同的碱基序列的、作为外引物的F3引物；
[0036](iv)具有与区域B3相同的碱基序列的、作为外引物的B3引物；和
[0037](v)一种以上额外的外引物，各额外的外引物具有与在与靶RNA互补的核酸中比区域B3更靠近5
’
末端侧处存在的任选的区域相同的碱基序列，
[0038]其中，FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物和一种以上额外的外引物的碱基序列中可能存在的尿嘧啶可以被置换为胸腺嘧啶。
[0039][3][0040]一种检测试样中的负链单链RNA病毒的方法，其包括使引物组与试样接触而进行逆转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种检测试样中的单链RNA病毒的方法，其包括使引物组与试样接触而进行逆转录环介导等温扩增反应的步骤，引物组基于单链RNA病毒的靶RNA的碱基序列和与该靶RNA互补的核酸的碱基序列来设计，在单链RNA病毒为正链单链RNA病毒的情况下，靶RNA在从5
’
末端到3
’
末端的方向上依次具有任选的区域F3、F2、F1、B1c、B2c和B3c，与靶RNA互补的核酸在从3
’
末端到5
’
末端的方向上依次具有任选的区域F3c、F2c、F1c、B1、B2和B3，在单链RNA病毒为负链单链RNA病毒的情况下，靶RNA在从3
’
末端到5
’
末端的方向上依次具有任选的区域F3c、F2c、F1c、B1、B2和B3，与靶RNA互补的核酸在从5
’
末端到3
’
末端的方向上依次具有任选的区域F3、F2、F1、B1c、B2c和B3c，引物组包含以下(i)～(v)：(i)在5
’
末端具有与区域F1c相同的碱基序列且在3
’
末端具有与区域F2相同的碱基序列的FIP引物；(ii)在5
’
末端具有与区域B1c相同的碱基序列且在3
’
末端具有与区域B2相同的碱基序列的BIP引物；(iii)具有与区域F3相同的碱基序列的、作为外引物的F3引物；(iv)具有与区域B3相同的碱基序列的、作为外引物的B3引物；以及(v)一种以上额外的外引物，各额外的外引物具有与在与靶RNA互补的核酸中比区域B3或区域F3更靠近5
’
末端侧处存在的任选的区域相同的碱基序列，其中，FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物和一种以上额外的外引物的碱基序列中可能存在的尿嘧啶可以被置换为胸腺嘧啶。2.如权利要求1所述的方法，其中，单链RNA病毒为正链单链RNA病毒，靶RNA在从5
’
末端到3
’
末端的方向上依次具有任选的区域F3、F2、F1、B1c、B2c和B3c，与靶RNA互补的核酸在从3
’
末端到5
’
末端的方向上依次具有任选的区域F3c、F2c、F1c、B1、B2和B3，各所述额外的外引物具有与在与靶RNA互补的核酸中比区域B3更靠近5
’
末端侧处存在的任选的区域相同的碱基序列。3.如权利要求1所述的方法，其中，单链RNA病毒为负链单链RNA病毒，靶RNA在从3
’
末端到5
’
末端的方向上依次具有任选的区域F3c、F2c、F1c、B1、B2和B3，与靶RNA互补的核酸在从5
’
...

【专利技术属性】
技术研发人员：山本满智子，横野航太，仙波晶平，道行悟，
申请(专利权)人：荣研化学株式会社，
类型：发明
国别省市：