一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒，该扩增方法包括如下步骤：配置混合液A、混合液B和混合液C，将混合液B、混合液C和混合液A依次加入PCR管内混匀后扩增；该方法能够解决现目前快速核酸检测技术中假阳性率较高和有效检测浓度范围较窄的技术问题。问题。问题。

【技术实现步骤摘要】
一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于核酸检测
，具体公开了一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]适合用于现场检测、临床诊断的快速、高通量核酸检测技术是急于被需要的。目前已开发了多种特定核酸靶标检测方法，比如实验室最常用的聚合酶链式反应PCR，它利用耐热DNA聚合酶，通过三组不同反应的扩增周期来实现特定DNA靶标的指数级扩增。这三种反应发生在不同温度下，因此PCR需要精密的热循环系统，但这种大型且昂贵的仪器需要限制了它在资源有限的现场诊断、非专业场所的应用。由于扩增子长度和DNA聚合酶反应速度的限制，反应时间较长。此外，检测病毒RNA时需要额外的反转录即将RNA分子逆转录为cDNA，再用进行扩增过程，这增加了样品处理和污染风险，并且整个过程所需要时间较长。这些传统的核酸检测方法存在复杂的样品处理、消耗昂贵试剂、检测量小、所需时间长等缺点，阻碍了基于PCR的分子诊断在需要非常快的分析持续时间、大样本量和有限资源的情况下的应用，有待进一步的优化和完善。
[0003]近年来开发的简单、灵活、快速的等温核酸扩增技术具有扩增能力优异、反应方案简单、所需样品量少等优点，弥补了PCR的一些不足，即不需热循环，使用简单、便携的仪器。等温扩增技术是通过目标核酸分子来触发下游级联反应，从而产生放大信号，所需反应时间大大缩短。因此，这些优点使等温核酸扩增技术在快速现场分析中具有显著优势，被广泛应用，并成为有很高前景的PCR技术的替代方法。其中，指数扩增反应EXPAR 由于其扩增子长度比大多数等温核酸扩增方法的扩增子短，可在几分钟内将一段短寡核苷酸即触发序列指数放大，在短时间内具有较高的扩增效率而从众多等温核酸扩增技术中脱颖而出。EXPAR反应使用较少的酶和蛋白质，在中等温度下进行，只需一个模板(X`
‑
X`模板：其序列由两个拷贝的触发序列X的互补序列组成，中间由产生切割酶识别和切割位点的少数碱基隔开)。EXPAR反应的核心由触发序列X引发，当触发序列X与单链模板杂交时，由DNA聚合酶延伸形成完整双链，然后缺口内切酶切割顶链，聚合酶的链置换活性释放出另一个相同的触发序列X。这些新形成的触发序列X启动新一轮的扩增，形成类似分子链式反应(一个反应的产物催化生成相同产物的进一步反应)，实现指数扩增，可用特异性染料SYBR Green 实时监测扩增过程。由于EXPAR具有快速、等温、高扩增效率、高灵敏度等特点，已被用于病毒与miRNA、酶活性、蛋白质等靶标的检测。
[0004]最近开发了一种新的、无需逆转录(RTF)、更快速、更简单的检测新冠病毒SARS
‑
CoV
‑
2的等温扩增方法，称为RTF
‑
EXPAR。该方法利用核酸内切酶BstNI在病毒RNA与Binder DNA X形成杂合DNA/RNA双链时切割DNA链，生成触发序列X，触发下游EXPAR反应，从而放大病毒检测信号，避免了漫长的逆转录步骤，在一个体系里面完成RNA向DNA的转换和扩增步骤即“一步法”设置，该方法的检测时间、灵敏度均优于实验室常用的RT
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qPCR和针对SARS
‑
CoV
‑
2开发的LAMP方法。
[0005]EXPAR反应中存在一个主要的限制性问题是在没有触发器存在时即反应仅包含除触发序列X外的所有成分时，仍具有较高的背景扩增信号。这种非特异性背景扩增现象限制了EXPAR反应的可分析灵敏度，阻碍了它在微量核酸检测中的应用。有研究探索了EXPAR反应非特异性背景扩增的机制，发现它是由一种非常规的DNA聚合酶活性引起的，这种现象在其他核酸扩增方法中也存在，但由于EXPAR的无限指数级正反馈设计使其效应更加明显。他们观察到聚合酶和EXPAR反应模板的预孵育会增加低温下模板的非特异性相互作用，从而显著加强背景扩增；而热启动可减少模板的非特异性相互作用，降低高背景扩增。另有研究证实非特异性模板相互作用导致DNA聚合酶对模板3`端非特异性延伸触发了背景扩增。在EXPAR反应中使用相对较高浓度的模板，这些模板会存在广泛的二级结构，这些二级结构易与聚合酶发生非特异性相互作用，而模板与反应中的其他核酸分子间存在的分子相互作用可能触发背景扩增，多个模板分子间相互作用也可触发聚合酶非特异性延伸，这些非特异性相互作用导致高背景信号的产生，降低反应扩增效率。
[0006]因此，需要开发有效的方法抑制EXPAR反应的高背景扩增信号，解决不良背景，提高该反应的灵敏度，确保反应的高扩增信号，促进EXPAR反应的实际应用。研究者们探索了保护单链模板以避免这种非特异性相互作用的策略，以抑制EXPAR的高背景信号，如使用单链DNA结合蛋白包覆单链模板。此外，氧化氢钴(CoOOH)纳米片已用于EXPAR，它可以利用其对单链和双链DNA的不同亲和力发挥物理阻断作用。这两种策略在抑制 EXPAR背景放大方面都表现出了有效性。然而，目前开发的EXPAR系统在检测相应靶点时仍具有较高的非特异性扩增，导致了严重的假阳性问题和较窄的有效检测浓度范围。

技术实现思路

[0007]本专利技术的第一目的在与提供一种用于快速核酸检测的体系，能够解决现目前快速核酸检测技术中假阳性率较高和有效检测浓度范围较窄的技术问题。
[0008]本专利技术的第二目的在于提供一种用于快速核酸检测的扩增方法，该方法能够解决现目前快速核酸检测技术中假阳性率较高和有效检测浓度范围较窄的技术问题。与现有技术相比，本专利技术至少具有如下的优点与积极效果：
[0009]本专利技术提供了一种用于快速核酸检测的体系、扩增方法及试剂盒，本专利技术优化了快速核酸扩增技术EXPAR，旨在抑制其非特异性扩增，提高反应的特异性和可分析灵敏性，建立一个优化、灵活、快速的EXPAR系统，从而可以有效、方便地用于特定核酸分子的快速检测。
附图说明
[0010]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0011]图1为本专利技术中EXPAR反应的实时荧光监测，(A
‑
C)使用无修饰模板X`
‑
X`(2)，在不同起始浓度的触发序列X下进行EXPAR反应的荧光扩增曲线图。触发序列X的起始浓度设为：100nM、10nM、1nM、100pM、 10pM、1pM、0。T4 gp32蛋白的浓度设三个梯度：200ng/μL(A)、
300ng/μL (B)、400ng/μL(C)，每10sec检测荧光反应，所有反应均用10U/μl的 Nt.BstNBI浓度；
[0012]图2为本专利技术中物理阻断结合化学阻断、减少缺口内切酶对EXPAR反应的影响，其中(A)EXPAR反应仅使用3`端己二醇修饰的单链模板X`...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于快速核酸检测的体系，其特征在于，包括CoOOH、修饰模板序列和触发序列；所述CoOOH、修饰模板序列和触发序列的体积比为(0.9
‑
1.1):(0.7
‑
0.8):(2.5
‑
3.5)；所述修饰模板序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述触发序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的用于快速核酸检测的体系，其特征在于，包括混合溶液A、混合溶液B和混合溶液C，所述混合液A包括水、10
×
等温缓冲液、BSA、Bst DNA聚合酶和NT.BstNBI内切酶，所述水、10
×
等温缓冲液、Bst DNA聚合酶和NT.BstNBI内切酶的体积比为(2.5
‑
3.0):(4.5
‑
5.0):(3.5
‑
4.0):(0.7
‑
0.8)；所述混合液B包括水、10
×
等温缓冲液、修饰模板序列、MgSO4、dNTPs、20
×
SYBR GreenⅠ、T4 gp32蛋白和CoOOH，所述水、10
×
等温缓冲液、修饰模板序列、MgSO4、dNTPs、20
×
SYBR GreenⅠ、T4 gp32蛋白和CoOOH的体积比为(5.0
‑
5.5):(2.0
‑
3.0):(0.7
‑
0.8):(2.2
‑
2.5):(1.4
‑
1.6):(0.7
‑
0.8):(0.2
‑
0.4):(0.9
‑
1.1)；所述混合液C包括所述触发序列，所述混合溶液C与所述混合溶液A的体积比为(2.5
‑
3.5):10。3.根据权利要求2所述的用于快速核酸检测的体系，其特征在于，所述10
×
等温缓冲液包括200mM T...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭颖，李冬月，郭葳，尚剑，王洁，李玥颖，张旗，汤文学，郭永军，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：