一种核酸试纸条快检试剂盒制造技术

本实用新型专利技术涉及生物试剂盒技术领域，且公开了一种核酸试纸条快检试剂盒，包括恒温扩增体系、基于基因编辑的核酸检测体系和可视化检测系统，所述恒温扩增体系包括RPA酶、反应缓冲液V、醋酸镁溶液和无核酸水，所述基于基因编辑的核酸检测体系包括Cas13a核酸酶、非特异性报告分子和检测缓冲液C，所述可视化检测系统包括侧向流动试纸条、检测层析液；本试剂盒操作简便，无需复杂的温控设备，快速高效，仅需1小时即可判读结果，扩增效率极高，并且污染风险低。低。低。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸试纸条快检试剂盒


[0001]本技术专利涉及生物试剂盒领域，具体为一种核酸试纸条快检试剂盒。

技术介绍

[0002]市面上靶标分子的检测方法主要分为两大类，一类是基于分子层面的RNA 核酸检测，涉及到的主要技术手段包括RT
‑
PCR法和基因组测序法，主要用于对靶标分子感染的早筛检测；第二类是基于免疫学原理的抗原抗体检测，方法学主要包括了酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法等，由于抗原抗体检测方法需在人体免疫系统做出抗体反应后才能检测，这类方法主要用于感染后的阳性人群筛查、治疗康复评估等检测依据。经典RT
‑
PCR检测方法检测周期长、假阴性率高并且对实验设备和人员操作技术要求高。而传统的抗原抗体检测方法，由于检测窗口期长，主要适用于感染后的阳性人群筛查、治疗康复评估等，不适用于早期大规模筛查。
[0003]恒温核酸扩增技术是可以与PCR技术相媲美的体外核酸扩增技术，其特点是在恒定的温度下进行反应，并且有效缩短检测时间。本技术专利的恒温扩增技术在结合基因编辑的基础上大大提高了检测灵敏度和特异性，通过可视化检测系统实现结果的快速判读。

技术实现思路

[0004](一)解决的技术问题
[0005]针对现有技术的不足，本技术提供了一种核酸试纸条快检试剂盒，解决了现有靶标分子核酸检测技术检测下限低、特异性差和操作流程复杂，耗时的问题，大大提高检测灵敏度的同时，提升检测的特异性，并且能够简化检测流程，适用于任何场景的靶标分子诊断和筛查。
[0006](二)技术方案
[0007]为实现上述目的，本技术提供如下技术方案：一种核酸试纸条快检试剂盒，包括恒温扩增体系、基于基因编辑的核酸检测体系和可视化检测系统，所述恒温扩增体系包括RPA酶、反应缓冲液V、醋酸镁溶液和无核酸水，所述基于基因编辑的核酸检测体系包括Cas13a核酸酶、非特异性报告分子和检测缓冲液C，所述可视化检测系统包括侧向流动试纸条、检测层析液。
[0008]优选的，所述恒温扩增体系中的所述RPA酶被制作成干粉并分装到八连管中，所述RPA重组酶包括细菌重组酶UvsX、辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白和dNTPs。
[0009]优选的，所述恒温扩增体系的反应缓冲液V包括30
‑
50mM的Tris PH7.9、 50
‑
70mM的醋酸钾、5
‑
10mM的乙酸镁、0.6
‑
1.2mM的DTT、1.8
‑
2.9mM的ATP、 10
‑
18mM的磷酸肌酸、60
‑
90ng/ul的肌酸激酶和质量浓度为4
‑
6％的聚乙二醇。
[0010]优选的，所述醋酸镁溶液的摩尔浓度为100
‑
300mM。
[0011]优选的，所述Cas13a核酸酶选择细菌蛋白表达系统进行纯化。
[0012]优选的，所述导向RNA包含Cas13a核酸酶识别序列和靶向靶标分子RNA 的互补序列。
[0013]优选的，所述非特异性报告分子序列为：
[0014]/56
‑
FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/，其中5
’
端用FAM标记，3
’
端用生物素标记。
[0015]优选的，所述检测缓冲液C包含1
‑
3U T7 DNA聚合酶、8
‑
12mM rNTPs和 2
‑
4mM的氯化镁。
[0016]优选的，所述侧向流动试纸条的前端包被有带FAM抗体的纳米金粒，检测线上包被有生物素抗体，质控线上包被有固定抗体。
[0017]优选的，所述检测层析液为无核酸的纯净水。
[0018](三)有益效果
[0019]本技术提供了一种核酸试纸条快检试剂盒，具备以下有益效果：
[0020]本试剂盒不仅能提升靶标分子检测下限，使低拷贝的分子得到检出，最低可检出5个拷贝，远远超出等温扩增原有的10000拷贝的检测灵敏度下限，提高扩增效率使检出率到达更高的要求，满足低拷贝模板的检出率，并且通过内外多对引物组的搭配，设计筛选出特异性最强的引物组合，能够有效提高特异性，使检测片段更加特异，等温扩增严格控制时间，使其在达到最低扩增量的同时，减少非特异性的扩增，有效降低污染的风险。
附图说明
[0021]图1为本技术的不同靶序列的检测结果。
具体实施方式
[0022]下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
[0023]实施例1
[0024]如图1所示，本技术提供一种技术方案：一种核酸试纸条快检试剂盒，包括恒温扩增体系、基于基因编辑的核酸检测体系和可视化检测系统，恒温扩增体系包括RPA酶、反应缓冲液V、醋酸镁溶液和无核酸水，基于基因编辑的核酸检测体系包括Cas13a核酸酶、导向RNA、非特异性报告分子、检测缓冲液C，可视化检测系统包括侧向流动试纸条、检测层析液，其中，引物组序列能够特异性识别靶序列，通过内外多对引物组的搭配，设计筛选出特异性最强的引物组合，能够有效提高特异性，减少非特异性的扩增，使检测片段更加特异，Cas13a核酸酶是一种针对RNA的核酸酶，核酸酶Cas13a的激活需要有导向RNA。
[0025]进一步的，恒温扩增体系的RPA酶被制作成干粉并分装到八连管中，恒温扩增体系采用PCR扩增的方式，通过内外多对引物组的搭配，扩增产生不同特异性片段，筛选出特异性最强的引物组合，能够有效提高特异性，减少非特异性的扩增，使检测片段更加特异，RPA重组酶包括细菌重组酶UvsX、辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白和dNTPs。
[0026]进一步的，恒温扩增体系的反应缓冲液V包括40mM的Tris PH7.9、64mM 的醋酸钾、
8mM的乙酸镁、0.8mM的DTT、2.4mM的ATP、16mM的磷酸肌酸、80ng/ul的肌酸激酶和质量浓度为5％的聚乙二醇。
[0027]进一步的，醋酸镁溶液的摩尔浓度为250mM。
[0028]进一步的，Cas13a核酸酶选择细菌蛋白表达系统进行纯化。
[0029]进一步的，导向RNA包含Cas13a核酸酶识别序列和靶标分子RNA的互补序列，靶标分子靶序列与RNA互补序列结合后，就会激活识别导向RNA的 Cas13a核酸酶，Cas13a核酸酶一旦被激活就具有了一般的RNA核酸酶活性，它不仅可以水解靶分子，更重要的是被激活后的Cas13a蛋白酶可以水解非特异性将附件的丰特异性报本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸试纸条快检试剂盒，包括恒温扩增体系、基于基因编辑的核酸检测体系和可视化检测系统，其特征在于：所述恒温扩增体系包括RPA酶、反应缓冲液V、醋酸镁溶液和无核酸水，所述基于基因编辑的核酸检测体系包括Cas13a核酸酶、非特异性报告分子和检测缓冲液C，所述可视化检测系统包括侧向流动试纸条、检测层析液。2.根据权利要求1所述的一种核酸试纸条快检试剂盒，其特征在于：所述恒温扩增体系中的所述RPA酶被制作成干粉并分装到八连管中，所述RPA酶是模拟生物遗传物质自身扩增复制机理，利用重组酶、聚合酶系列基因工程酶，在恒温条件下，快速、精准完成目标基因序列的扩增，达到与PCR扩增相同的效果。3.根据权利要求1所述的一种核酸试纸条快检试剂盒，其特征在于：所述醋酸镁溶液的摩尔浓度为100
‑
300mM。4.根据权利要求1所述的一种核酸试纸条快检试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：高轩，李西清，徐龙慧，程亚双，
申请(专利权)人：合肥元哉生物科技有限公司，
类型：新型
国别省市：