一种高通量微生物16SrRNA扩增子文库半自动化构建方法技术

本发明专利技术涉及高通量测序技术领域，且公开了一种高通量微生物16SrRNA扩增子文库半自动化构建方法，包括以下步骤：S1、将一定量的样品使用核酸提取试剂盒提取DNA，使用Qubit3.0荧光定量仪检测基因组DNA总量，利用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，选择高质量的DNA进一步实验。本发明专利技术通过设计随机不等碱基差异序列组合和i5

【技术实现步骤摘要】
一种高通量微生物16S rRNA扩增子文库半自动化构建方法


[0001]本专利技术涉及高通量测序
，具体为一种高通量微生物16S rRNA扩增子文库半自动化构建方法。

技术介绍

[0002]自然界中的微生物经常以群落的形式存在，对于微生物群落的物种组成及多样性的研究可以让我们进一步了解对群落内的不同微生物的相互作用以及微生物群落的功能。微生物多样性分析是以研究环境中微生物的种类和数量为目的，揭示随环境变化导致微生物群落结构变化的过程。其研究对象广泛，包括土壤、粪便、水体、动植物表面等。
[0003]近年来低成本的高通量测序技术快速发展，使通过测序的方式研究微生物群体成为现实。研究表明通过构建健康的肠道微生物菌群，可以达到瘦身的目的；母乳中微生物菌群与婴儿健康息息相关；通过改善患病小鼠肠道微生物菌群可以减少癫痫发作次数。这些成果的发表，吸引了更多学科领域的专家学者聚焦微生物群体研究。
[0004]在细菌基因组中，编码16S rRNA的rDNA基因具有良好的进化保守性，适宜分析的长度(约为1540bp)，以及与进化距离相匹配的良好变异性，所以成为细菌分子鉴定的标准标识序列。16S rDNA的序列包含9个可变区(variable region)和10个保守区(constant region)。保守序列区域反应了生物物种间的亲缘关系，而可变序列区域则能体现物种间的差异。因此可以根据可变区来确定微生物种属。由于illumina测序平台读长的限制，只能研究16S rDNA的部分可变区域。一般研究区域为V3<br/>‑
V4区域。
[0005]目前用于16S/18SrRNA扩增测序的商业平台包括针对选定高可变区域的MiSeq/HiSeq平台、纳米孔测序平台、PacBio或Sequel平台等，其中Miseq平台是被选择和应用较多的一种平台。针对微生物V3
‑
V4或其他选定区域的16S rRNA基因扩增子测序文库已为MiSeq平台使用双端测序方法构建，传统的文库构建方法在处理少于96个样品时，易于操作且价格相对较低，但在处理数百或数千个样品时通量低、流程慢、耗时长且价格昂贵。
[0006]基因测序领域，一般采用扩增子建库方式实现目的基因区域的研究。现在适用于Miseq测序平台的扩增子文库构建方法主要有两种，一种是PCR产物建库方法，即两步扩增法；一种是融合引物建库，即一步扩增法。两种建库方法殊途同归，得到相同的文库结构，5
’
端到3
’
端依次为：P5接头，i5
‑
index序列，Read1测序引物，随机差异序列，16S rDNA可变区域扩增引物上游引物序列，16S rDNA可变区域待测序序列，16S rDNA可变区域扩增引物下游引物序列，i7
‑
index测序引物序列(Read2测序引物为方向互补序列)，i7
‑
index序列，P7接头。虽然通过随机差异序列可以缓解测序过程中碱基不均衡问题，但依然需要10％～30％的phix碱基平衡文库提高测序过程中碱基随机性。加入一定比例的phix碱基平衡文库会造成相应比例的数据量浪费。针对以上问题，迫切需要对现有扩增子文库结构进行优化改进，提高测序过程中碱基随机性，从而提高测序质量，减少phix碱基平衡文库添加比例，达到提高测序质量和数据产量的目的。
[0007]针对以上情况，本申请提供了一种高通量微生物16S rRNA扩增子文库半自动化构
建方法用于解决上述问题。

技术实现思路

[0008]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术可用于质谱流式的微量样本检测，并且与已有的样本前处理、上机、数据分析等步骤兼容，对所使用的的载体细胞种类没有限制，处理载体细胞的方式对待测细胞的蛋白检测没有影响。该方法处理方便，所用处理方法、试剂皆为常用方法、试剂，操作简便。
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种高通量微生物16S rRNA扩增子文库半自动化构建方法，包括以下步骤：
[0010]S1、将一定量的样品使用核酸提取试剂盒提取DNA，使用Qubit3.0荧光定量仪检测基因组DNA总量，利用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，选择高质量的DNA进一步实验；
[0011]S2、采用PAGE合成方式合成测序引物，测序引物包含内引物、外引物，其中内引物由扩增区域、差异序列和搭桥区域组成，差异序列为适用于16SrDNA的V3
‑
V4区的1～7bp不等碱基差异序列，外引物由搭桥区域、index序列、测序接头组成，index序列为最优i5
‑
index和i7
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index组合；
[0012]S3、PCR产物建库：针对S1中选择的高质量DNA样品的16S rDNA的V3
‑
V4区域进行扩增，通过内外两组扩增引物经过两步扩增完成文库构建，内引物扩增16S rDNA V3
‑
V4区，外引物携带测序Adapter序列，扩增时外引物利用搭桥区域对内引物的扩增产物再进行扩增，以此实现16S rDNA的V3
‑
V4区域的富集和样本的区分；
[0013]S4、融合引物建库：将16S rDNA的V3
‑
V4区扩增引物序列与测序Adapter序列融合成一组较长的融合引物，针对S1中选择的高质量的DNA样品的16SrDNA的V3
‑
V4区域进行测序，通过一步扩增完成文库构建；
[0014]S5、质检和测序：使用胶回收试剂盒对目的片段进行琼脂糖凝胶回收，回收范围为500
‑
750bp，DNA回收后，对切胶文库进行质检，质检合格后，以28pM的文库浓度上机测序，测序平台为Illumina的Miseq平台，测序策略为PE 300，具体采用PE 301+8+8+301，Miseq测序过程中，AC共用红激光，GT共用绿激光；
[0015]S6、数据质量产量对比分析：对比使用普通差异序列组合和最优差异序列组合的Miseq下机数据质量和产量差异；对比普通i5
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index、i7
‑
index组合和最优i5
‑
index、i7
‑
index组合的Miseq下机数据中index数据质量Q30％差异；
[0016]S7、数据分析：采用Kolmogorov
‑
Smirnov检验和皮尔逊相关系数，从科和属水平上对来自16S扩增子测序数据的OTUs进行总体比较。
[0017]优选的，所述S1中样品为土壤或粪便，所述一定量的样品的质量为0.2g
‑
1g。
[0018]优选的，所述高质量的DNA为DNA总质量在1μg以上，琼脂糖凝胶电泳的DNA主带在10kb以上且无小于3kb的降解DNA片段。
[0019]优选的，所述内引物的序列如下：
[0020]内引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高通量微生物16SrRNA扩增子文库半自动化构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将一定量的样品使用核酸提取试剂盒提取DNA，使用Qubit3.0荧光定量仪检测基因组DNA总量，利用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，选择高质量的DNA进一步实验；S2、采用PAGE合成方式合成测序引物，测序引物包含内引物、外引物，其中内引物由扩增区域、差异序列和搭桥区域组成，差异序列为适用于16SrDNA的V3
‑
V4区的1～7bp不等碱基差异序列，外引物由搭桥区域、index序列、测序接头组成，index序列为最优i5
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index和i7
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index组合；S3、PCR产物建库：针对S1中选择的高质量DNA样品的16SrDNA的V3
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V4区域进行扩增，通过内外两组扩增引物经过两步扩增完成文库构建，内引物扩增16SrDNAV3
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V4区，外引物携带测序Adapter序列，扩增时外引物利用搭桥区域对内引物的扩增产物再进行扩增，以此实现16SrDNA的V3
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V4区域的富集和样本的区分；S4、融合引物建库：将16SrDNA的V3
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V4区扩增引物序列与测序Adapter序列融合成一组较长的融合引物，针对S1中选择的高质量的DNA样品的16SrDNA的V3
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V4区域进行测序，通过一步扩增完成文库构建；S5、质检和测序：使用胶回收试剂盒对目的片段进行琼脂糖凝胶回收，回收范围为500
‑
750bp，DNA回收后，对切胶文库进行质检，质检合格后，以28pM的文库浓度上机测序，测序平台为Illumina的Miseq平台，测序策略为PE300，具体采用PE301+8+8+301，Miseq测序过程中，AC共用红激光，GT共用绿激光；S6、数据质量产量对比分析：对比使用普通差异序列组合和最优差异序列组合的Miseq下机数据质量和产量差异；对比普通i5
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index、i7
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index组合和最优i5
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index、i7
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index组合的Miseq下机数据中index数据质量Q30％差异；S7、数据分析：采用Kolmogorov
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Smirnov检验和皮尔逊相关系数，从科和属水平上对来自16S扩增子测序数据的OTUs进行总体比较。2.根据权利要求1所述的一种高通量微生物16SrRNA扩增子文库半自动化构建方法，其特征在于：所述S1中样品为土壤或粪便，所述一定量的样品的质量为0.2g
‑
1g。3.根据权利要求1所述的一种高通量微生物16SrRNA扩增子文库半自动化构建方法，其特征在于：所述高质量的DNA为DNA总质量在1μg以上，琼脂糖凝胶电泳的DNA主带在10kb以上且无小于3kb的降解DNA片段。4.根据权利要求1所述的一种高通量微生物16SrRNA扩增子文库半自动化构建方法，其特征在于：所述内引物的序列如下：内引物F：5
’‑
ACACTGACGACATGGTTCTACA
‑
1～7bp不等碱基差异序列
‑
CCTACGGGNGGCWGCAG
‑3’
；内引物R：5
’‑
TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT
‑
1～7bp不等碱基差异序列
‑
GGACTACHVGGGTWTCTAAT
‑3’
。5.根据权利要求4所述的一种高通量微生物16SrRNA扩增子文库半自动化构建方法，其特征在于：所述内引物F中的1～7bp不等碱基差异序列为T、AT、ATA、ATAT、TTATA、TAGTGT、CATCTAT中的一种，内引物R中的1～7bp不等碱基差异序列为A、AC、CTA、CATA、ACTCA、TACTAC、CACTCAT中的一种。
6.根据权利要求1所述的一种高通量微生物16SrRNA扩增子文库半自动化构建方法，其特征在于：所述外引物的序列如下：外引物F：5
’‑
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：李西清，徐文强，刘晓蕙，任泓霖，刘彦晨曦，金旭，刘旸，张红钦，李梦乐，
申请(专利权)人：合肥元哉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：