一种筛选小鼠精子发生相关互作蛋白的方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种筛选小鼠精子发生相关互作蛋白的方法及应用，通过提取小鼠单倍体生精细胞RNA反转录、扩增合成双链cDNA，并与pGADT7

【技术实现步骤摘要】
一种筛选小鼠精子发生相关互作蛋白的方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种筛选小鼠精子发生相关互作蛋白的方法、一种小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及应用。

技术介绍

[0002]不孕不育症是一种多因素、复杂的病理生理过程，研究表明异常精液参数是近50％非自愿无子女的不育男性中主要的相关因素，主要表现为精子发生障碍及形成异常，其中精子发生障碍约占男性不育因素的85％。精子发生是雄性生殖系统中高度特异、严格管控的多阶段持续分化的生物学进程，精子发生异常将导致少弱畸精子症，形成雄性不育表型。精子发生涉及有丝分裂、减数分裂、遗传重组、染色质重塑、精子变形等复杂的生物学变化，这一高度有序的进程受到众多基因及其编码蛋白的严格调控，基因表达紊乱将导致精子发生障碍产生不育表型。精子发生过程包含多种睾丸特异性基因在不同时期的特异性表达，其产物蛋白的表达多与精子细胞RNA的表达丰度相应，超过80％的蛋白质是与其他蛋白质相互作用形成稳定或瞬时复合物结构而发挥作用。在精子发生中，各阶段特异性基因及其蛋白质产物的正确表达是精子形成的重要保障。
[0003]酵母双杂交(Yeast Two
‑
hybrid System)是利用遗传学方法在酵母真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的高通量生物学技术，应用于蛋白与宿主细胞的互作机制、蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域。
[0004]目前，小鼠、大鼠、兔、羊和人类睾丸组织cDNA文库已成功构建，由于睾丸包括生精细胞、间质细胞及支持细胞等多种成分，因此利用睾丸cDNA文库筛选与精子发生相关蛋白其特异性及阳性率均不理想，同时，以往研究蛋白质互作的生化技术，如偶联、免疫共沉淀、以及串联亲和层析等体外实验易受环境、实验条件等诸多因素影响的问题。因此迫切需要进一步构建单倍体生精细胞cDNA文库进行精子发生的相关研究。目前小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库构建未见商品化销售及文献报道，因而该文库的成功构建，将成为探究小鼠精子发生相关机制的基本工具。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对上述现有技术存在的问题，提供一种筛选小鼠精子发生相关互作蛋白的方法，一种小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及应用。
[0006]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0007]本专利技术目的之一在于，提供一种小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建方法。本方法适用于构建某种单细胞酵母双杂交cDNA文库，可以显著提升对标研究相关领域互作蛋白筛选的阳性率及灵敏度，具有操作简便、成本低廉、适用范围广等特点。
[0008]一种小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建方法，所述构建方法如下：
[0009]步骤S1：小鼠单倍体生精细胞的分选纯度与鉴定；
[0010]步骤S2：提取步骤S1中筛选出的小鼠单倍体生精细胞RNA，并反转录成单链cDNA，
将单链cDNA通过PCR扩增形成双链cDNA并纯化；
[0011]步骤S3：应用醋酸锂法将双链cDNA与线性载体pGADT7
‑
Rec共转化至感受态酵母细胞Y187中构建酵母双杂交cDNA文库；
[0012]步骤S4：酵母双杂交cDNA文库的鉴定。
[0013]所述步骤S1具体如下：取成年野生型小鼠睾丸经酶消化后获取睾丸单细胞悬液，使用活细胞DNA荧光染料Hochest33342处理细胞，于流式细胞仪分选小鼠单倍体生精细胞；Hochest33342+PNA双荧光鉴定小鼠单倍体生精细胞分选纯度。
[0014]优选的，所述步骤S2具体如下：采用酵母双杂交cDNA文库构建试剂盒的方法，以1μg小鼠单倍体生精细胞总RNA为模板反转录成单链cDNA，再通过PCR扩增单链cDNA形成双链cDNA并对双链cDNA进行纯化，使用1.2％的琼脂糖对每个样品的PCR产物进行分析。
[0015]优选的，所述反转录过程中应用的引物为SMARIII及CDSIII，SMARIII如SEQ ID NO:1所示，CDSIII如SEQ ID NO:2所示；所述通过PCR扩增单链cDNA形成双链cDNA中应用的引物为5
’
PCR Primer及3
’
PCR Primer，5
’
PCR Primer如SEQ ID NO:3所示，3
’
PCR Primer如SEQ ID NO:4所示。
[0016]优选的，所述步骤S3具体如下：将双链cDNA、pGADT7
‑
Rec、变性鲑鱼精DNA转化至感受态酵母细胞Y187后涂于SD/
‑
Leu平板上，30℃培养3
‑
5天直至克隆出现；洗脱下所有克隆，收集所有的液体，调整细胞密度约为2
×
107ꢀ‑2×
108个/ml，按每管1ml分装，于
‑
80℃冻存备用。
[0017]本专利技术的目的之二在于，提供一种筛选小鼠精子发生相关互作蛋白的实验方法，为深入研究精子发生相关蛋白的功能及分子机制提供可能。
[0018]本专利技术构建的酵母双杂交cDNA文库在筛选小鼠精子发生相关互作蛋白中的应用。
[0019]本专利技术目的之三在于，提供一种小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的应用实例。
[0020]应用的方法，所述方法如下：
[0021]步骤(1)：目的蛋白编码基因酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7
‑
X的构建及鉴定(以X替代基因名称，以下相同)；
[0022]根据NCBI数据库小鼠X基因序列设计特异性PCR引物并扩增X的开放阅读框序列；1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并割胶回收PCR产物，采用pGEMT
‑
easy试剂盒将PCR产物插入pGEM
‑
T
‑
easy载体内，经序列测定确认正确无误后，使用特定的限制性内切酶双酶切该质粒及pGBKT7载体，转化至大肠杆菌，经双酶切鉴定筛选阳性克隆。
[0023]步骤(2)：采用醋酸锂法分别将诱饵质粒pGBKT7
‑
X及空载质粒pGBKT7转化至感受态酵母细胞AH109及Y187中；
[0024]各挑取一个新鲜的AH109及Yl87单克隆菌落至两管10mL YPDA液体培养基中30℃培养过夜。次日取过夜酵母培养液加入100mL
‑
200mL新鲜YPDA培养液中调0D600至0.3左右，30℃培养2h
‑
3h左右，测0D600约0.6，收集酵母培养液室温700g离心5min，弃上清。用超纯水洗涤沉淀后离心弃上清，用1mL新鲜配制的1
×
TE/LiAc重悬细胞，即为酵母感受态细胞。
[0025]取pGBKT7
‑
X及pGBKT7、pGBKT7
‑
p53(阳性对照质粒)各1μg，分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法如下：步骤S1：小鼠单倍体生精细胞的分选纯度与鉴定；步骤S2：提取步骤S1中筛选出的小鼠单倍体生精细胞RNA，并反转录成单链cDNA，将单链cDNA通过PCR扩增形成双链cDNA并纯化；步骤S3：应用醋酸锂法将双链cDNA与线性载体pGADT7
‑
Rec共转化至感受态酵母细胞Y187中构建酵母双杂交cDNA文库；步骤S4：酵母双杂交cDNA文库的鉴定。2.根据权利要求1所述的小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述步骤S1具体如下：取成年野生型小鼠睾丸经酶消化后获取睾丸单细胞悬液，使用活细胞DNA荧光染料Hochest33342处理细胞，于流式细胞仪分选小鼠单倍体生精细胞；Hochest33342+PNA双荧光鉴定小鼠单倍体生精细胞分选纯度。3.根据权利要求1所述的小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述步骤S2具体如下：采用酵母双杂交cDNA文库构建试剂盒的方法，以1μg小鼠单倍体生精细胞总RNA为模板，反转录成单链cDNA，再通过PCR扩增单链cDNA形成双链cDNA并对双链cDNA进行纯化，使用1.2％的琼脂糖对每个样品的PCR产物进行分析。4.根据权利要求3所述的小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述反转录过程中应用的引物为SMARIII及CDSIII，SMARIII如SEQ ID NO:1所示，CDSIII如SEQ ID NO:2所示；所述通过PCR扩增单链cDNA形成双链cDNA中应用的引物为5
’
PCR Primer及3
’
PCR Primer，5
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PCR Primer如SEQ ID NO:3所示，3
’
PCR Primer如SEQ ID NO:4所示。5.根据权利要求1所述的小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述步骤S3具体如下：将双链cDNA、pGADT7
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Rec、变性鲑鱼精DNA转化至感受态酵母细胞Y187后涂于SD/
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Leu平板上，30℃培养3
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5天直至克隆出现；洗脱下所有克隆，收集所有的液体，调整细胞密度约为2
×
107‑2×
108个/ml，按每管1ml分装，于
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80℃冻存备用。6.权利要求1所述的小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建方法构建的酵母双杂交cDNA文库在筛选小鼠精子发生相关互作蛋白中的应用。7.权利要求6所述的应用的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑英，周慧萍，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：