一种全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法技术

本发明专利技术公开了一种全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法，涉及基因组学、表观遗传学和分子生物学技术领域。其内容包括如下步骤：5hmC标记反应；点击化学反应；样本DNA片段化；通过磁珠将片段化产物纯化；5hmC片段化DNA捕获；洗涤捕获产物；还原反应；APOBEC酶脱氨反应；脱氨产物的纯化；双链转化反应；末端修复和3

【技术实现步骤摘要】
一种全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法


[0001]本专利技术涉及基因组学、表观遗传学和分子生物学
，具体而言，涉及一种全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法。

技术介绍

[0002]表观遗传学修饰是指非基因序列改变导致的基因表达水平的变化，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA和基因印迹等。这些表观遗传学改变通过开放或关闭某些特定基因，在胚胎发育、细胞分化、组织特异性蛋白表达、维持基因组完整性和染色体稳定性等方面发挥重要作用。5
‑
羟甲基胞嘧啶(5
‑
hydroxymethylcytosine,5hmC)是一种新发现的表观遗传学修饰碱基，被称之为人类DNA的第6种碱基，以低水平存在于哺乳动物的多种细胞类型中。5hmC是甲基化胞嘧啶(5
‑
methylated cytosine,5mC)的羟基化形式，它是10
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11易位(ten
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eleven translocation,TET)家族蛋白将5mC氧化而形成的产物。
[0003]1952年，Wyatt等人首次在T
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偶数系噬菌体中发现了5hmC表观标志。1972年，Penn等人通过色谱分析技术在成年大鼠、小鼠以及青蛙脑组织中发现5hmC，但当时被认为是由于氧化反应引起的DNA异常，故未被重视。直到2009年，多个研究发现在小鼠浦肯野细胞及小脑颗粒细胞中存在5hmC而被广泛关注。2011年，科学家发现在人体中，不同组织之间5hmC的分布存在着差异性：在肝、肾、脑和大肠组织中，5hmC含量较高，而在肺组织内含量相对较低，最低含量的5hmC出现在乳腺、心脏和胎盘组织中。5hmC在细胞分化及组织发育进程中发挥重要作用。2012年，Freudenberg等人发现在小鼠胚胎干细胞中，随着细胞的分化，5hmC含量逐渐降低，从而导致胚胎干细胞多功能性的丧失，这表明5hmC与胚胎干细胞的分化和个体早期发育密切相关。此外，Orr等人发现当人脑组织处于发育阶段时，胎儿皮质等较分化部分的5hmC含量高，而在脑室周围的祖细胞区域含量低，这表明5hmC在中枢神经系统发育中有着特定的作用。
[0004]5hmC的含量可作为区别肿瘤组织和正常组织的指标之一，能够指导肿瘤诊断，甚至为肿瘤治疗提供表观线索。Yang等人发现5hmC在人类肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌组织中较周围正常组织含量低；Orr等人也发现在恶性胶质瘤中5hmC含量变低；此外，Lian等人的研究结果表明黑色素瘤组织中没有5hmC的存在，因此可作为是否患有黑色素瘤的依据。5hmC水平的异常还可能破坏造血细胞内的平衡，导致造血细胞增殖及异常成熟，从而发展为肿瘤细胞。Pronier等人发现，在骨髓增殖性肿瘤(MPN)、骨髓增生异常综合症(MDS)以及急性髓细胞白血病(AML)等多种造血系统肿瘤的形成是由于细胞中TET2表达受到抑制，导致5hmC水平降低，并干扰髓系细胞发育分化，进而发展成髓系肿瘤细胞。
[0005]目前，DNA羟甲基化的检测技术主要分为两类：依赖抗原
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抗体免疫作用原理的沉淀检测技术和不依赖免疫作用原理的非沉淀检测技术。依赖抗原
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抗体免疫作用沉淀检测技术的原理是通过一些化学反应或酶促反应对5hmC进行特殊处理，然后采用沉淀技术对含有5hmC的DNA片段进行特异性捕获，方法主要包括结合蛋白J沉淀法(J
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binding protein，
JBP)、糖基化、高碘酸氧化和生物素化(glucosylation，periodate oxidation，biotinylation，GLIB)。非沉淀法检测技术主要包括质谱法(mass spectrometry)、5hmC葡萄糖基化定量测定(Quantitative hmC Glucosylation assay)、薄层色谱法(thin
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layer chromatography)、高压液相色谱法(high pressure liquid chromatography)和单分子实时DNA测序(single molecule real
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time DNA sequencing，SMRT)。近年来，随着高通量测序技术方法的不断革新和测序费用的持续降低，其已被广泛应用于各大生物研究领域。
[0006]尽管DNA羟甲基化高通量检测技术多种多样，但它们各有优缺点。基于亚硫酸氢盐的方法如OxBS
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seq、TAB
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seq，能够在单碱基分辨率上检测5hmC，为科学和疾病研究提供了较为全面和精确的定量信息。然而，同时氧化和亚硫酸氢盐处理也会导致基因组DNA的大量损失，这限制了它们在有限样品量的研究实用性。相比之下，使用AID/APOBEC家族DNA脱氨酶APOBEC3A (A3A)的转化测序方法(ACE
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seq)，在单碱基精确度的基础上，能够有效保证DNA的完整性。但在全基因组测序水平上想要达到分析需求，测序深度至少需要达到30
×
(人的样本需要至少90G测序数据)，无疑增加了测序费用和数据储存、分析难度。此外，OxBS
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seq还需同时构建BS
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seq文库，这种联合测序方式虽能实现对5hmC单碱基分辨率，但该方法除了极大的样本需求量和高昂的测序费用之外，对实验操作人员以及数据分析人员的专业素质要求极高，否则极容易出现偏差，导致数据结果可信度降低。而基于富集的分析方法在增加测序深度的同时能够有效降低测序成本。经典的羟甲基化捕获方法(5hmC
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Seal)是由芝加哥大学何川教授团队开创，其流程主要包括：1)DNA样本片段化，2)末端修复加“A”，3)接头连接，4)纯化，5)5hmC标记及点击化学反应，6)亲和富集，7)PCR扩增。该方法经过5年的优化，具有用时少、操作方便、测序数据量低及便于大样本量数据分析等优点，但无法实现单碱基精确度。2021年，Xiaogang Li等将脱氨酶A3A应用于5hmC
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Seal方法之上，专利技术了在单碱基精确度的基础上，用较少数据量检测全基因组范围DNA羟甲基化修饰的新方法DIP
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CAB
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Seq。
[0007]传统的5hmC
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Seal及DIP
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CAB
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Seq方法都是建立在5hmC捕获基础上，文库富集扩增步骤仍采用带磁珠扩增法，导致20％以上捕获假阳性率，极大影响了数据的可信度、增加了数据结果验证的试错次数；同时，DIP
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CAB
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Seq文库构建的实现需要羟甲基化修饰接头，并不具有通用性；此外，DIP
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CAB
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Seq方法实验结果不稳定，重复性较差。
[0008]鉴于此，特提出本专利技术。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法，其特征在于，其内容包括如下步骤：5hmC标记反应；点击化学反应；样本DNA片段化；通过磁珠将片段化产物纯化；5hmC片段化DNA捕获；洗涤捕获产物；还原反应；APOBEC酶脱氨反应；脱氨产物的纯化；双链转化反应；末端修复和3
′
端加A反应；接头连接；连接产物纯化与双分选；文库扩增；文库纯化；所述5hmC标记反应是指采用糖基化标记体系对基因组DNA上的5hmC进行标记；所述点击化学反应是将DBCO
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PEG3
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S
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S
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Biotin与5hmC标记的反应产物进行混合反应；所述样本DNA片段化是采用超声波对样本DNA进行片段化；所述5hmC片段化DNA捕获是采用链霉亲和素磁珠对片段化了的含有5hmC的DNA进行捕获；所述洗涤捕获产物包括：采用Buffer清洗磁珠3次后用ddH2O清洗磁珠1
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3次；所述APOBEC酶脱氨反应是将未糖基化标记的C和5mC脱氨为U；所述双链转化反应是采用Klenow Fragment将纯化后的脱氨产物转化为双链DNA。2.根据权利要求1所述的全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法，其特征在于，所述5hmC标记反应的反应体系包括：UDP
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N3
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Glu、基因组DNA、HEPES、MgCl2、T4
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β
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葡糖基转移酶(T4 Phageβ
‑
glucosyltransferase，βGT)，所述5hmC标记反应是在35
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37℃孵育1
‑
2h。3.根据权利要求1所述的全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法，其特征在于，所述点击化学反应中，所述DBCO
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PEG3
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S
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S
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Biotin与5hmC标记的反应产物的体积比为1:20
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24；所述点击化学反应是在35
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37℃孵育1
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2h；优选地，所述DBCO
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PEG3
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S
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S
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Bio...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈清，赖伟，薛添香，张杰，聂小挺，
申请(专利权)人：生工生物工程上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：