游离DNA甲基化文库构建方法及其文库、应用和试剂盒技术

一种游离DNA甲基化文库构建方法及其文库、应用和试剂盒，构建方法包括：提供游离DNA样本并将其变性为单链DNA；将单链DNA两端连接胞嘧啶均有甲基化修饰的接头序列；将连接有接头序列的单链DNA进行延伸反应，形成延伸片段，得到双链DNA；将双链DNA中带有甲基化修饰的胞嘧啶进行氧化反应形成受保护胞嘧啶；除去带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的延伸片段，得到带有受保护胞嘧啶的单链DNA；将带有受保护胞嘧啶的单链DNA中未甲基化修饰的胞嘧啶进行脱氨基反应，得到带有尿嘧啶的DNA；将带有尿嘧啶的单链DNA进行扩增反应，得到游离DNA甲基化文库。本公开实施例的构建方法可以提高甲基化检测的准确性和文库产量。测的准确性和文库产量。测的准确性和文库产量。

【技术实现步骤摘要】
游离DNA甲基化文库构建方法及其文库、应用和试剂盒


[0001]本公开实施例涉及但不限于基因测序
，尤其涉及一种游离DNA甲基化文库构建方法及其文库、应用和试剂盒。

技术介绍

[0002]基因组DNA中的CpG位点甲基化是基因表达、组织分化、器官发育、衰老和肿瘤发生的重要表观遗传学调控机制。DNA甲基化是指胞嘧啶碱基的嘧啶环第5位碳原子上，原有的一个氢原子被替换成甲基，形成5
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甲基胞嘧啶。游离DNA、循环游离DNA(Circulating free DNA，cfDNA)或者细胞游离DNA(Cell free DNA，cfDNA)，是释放到血浆中的降解的DNA片段，大小约为185bp至200bp。有研究表明，在临床癌症诊断前四年就能在cfDNA中检测到甲基化的变化。此外，近3000万个甲基化位点分布在人类基因组中，为癌症检测提供了丰富的信号。DNA甲基化发生在肿瘤发生的早期，有时甚至发生在基因突变之前，因此，基于表观遗传改变(甲基化)的cfDNA测序被认为是有希望的癌症早期检测方法。

技术实现思路

[0003]以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制本公开的保护范围。
[0004]本公开实施例提供了一种游离DNA甲基化文库构建方法，所述构建方法包括：
[0005]提供游离DNA样本；
[0006]将所述游离DNA样本变性为单链DNA；
[0007]将所述单链DNA与含有胞嘧啶且所述胞嘧啶均有甲基化修饰的接头序列进行连接反应，使所述单链DNA两端各连接一个接头序列，得到两端连接有接头序列的单链DNA；
[0008]将所述两端连接有接头序列的单链DNA进行延伸反应，所述延伸反应形成延伸片段，所述延伸片段的两端分别与所述两端连接有接头序列的单链DNA两端的接头序列连接，形成两端连接有接头序列的双链DNA；
[0009]将所述双链DNA中带有甲基化修饰的胞嘧啶进行氧化反应形成受保护胞嘧啶，得到带有受保护胞嘧啶的双链DNA；
[0010]除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段，得到带有受保护胞嘧啶的单链DNA；
[0011]将所述带有受保护胞嘧啶的单链DNA中未甲基化修饰的胞嘧啶进行脱氨基反应形成尿嘧啶，得到带有尿嘧啶的DNA；
[0012]将所述带有尿嘧啶的单链DNA进行扩增反应，得到游离DNA甲基化文库。
[0013]在本公开的示例性实施例中，所述延伸片段中含有至少一个尿嘧啶。
[0014]在本公开的示例性实施例中，所述延伸反应所采用的试剂可以包括：Klenow反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸的混合液、吐温20水溶液和Klenow Fragment。
[0015]在本公开的示例性实施例中，
[0016]脱氧核糖核苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸的混合液的工作浓度可以为0.1mM至0.4mM；
[0017]在所述吐温20水溶液中，吐温20的质量与水的体积之比为(0.03至0.1)g:100ml；
[0018]所述Klenow Fragment的工作浓度可以为0.02U/μL至0.08U/μL。
[0019]在本公开的示例性实施例中，所述延伸反应的反应条件可以包括：反应温度为20℃，反应时间为15min；所述延伸反应结束后将反应器的温度维持在4℃。
[0020]在本公开的示例性实施例中，所述除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段可以包括：
[0021]采用UDG酶进行消化反应，使所述延伸片段中的所述尿嘧啶降解，从而除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段。
[0022]在本公开的示例性实施例中，所述消化反应可以包括第一消化阶段和第二消化阶段；所述第一消化阶段的反应温度可以为37℃，反应时间可以为20min；所述第二消化阶段的反应温度可以为50℃，反应时间可以为5min。
[0023]在本公开的示例性实施例中，所述接头序列可以包括第一接头序列和第二接头序列，所述第一接头序列可以由第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列形成，所述第二接头序列可以由第三寡核苷酸序列和第四寡核苷酸序列形成，所述第一寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.1所示，所述第二寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.2所示，所述第三寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.3所示，所述第四寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.4所示。
[0024]在本公开的示例性实施例中，所述连接反应所采用的试剂还可以包括：聚乙二醇水溶液、DNA连接酶缓冲液、二硫苏糖醇、腺嘌呤核苷三磷酸、多核苷酸激酶和DNA连接酶。
[0025]在本公开的示例性实施例中，
[0026]在所述聚乙二醇水溶液中，聚乙二醇的质量与水的体积之比可以为(5至20)g:100ml；
[0027]所述二硫苏糖醇的工作浓度可以为0.01M至0.05M；
[0028]所述腺嘌呤核苷三磷酸的工作浓度可以为0.5mM至2mM；
[0029]所述多核苷酸激酶的工作浓度可以为0.1U/μL至0.4U/μL；
[0030]所述DNA连接酶的工作浓度可以为2U/μL至5U/μL。
[0031]在本公开的示例性实施例中，所述连接反应的反应条件可以包括：反应温度为37℃，反应时间为45min。
[0032]在本公开的示例性实施例中，所述受保护胞嘧啶可以为羧基胞嘧啶。
[0033]在本公开的示例性实施例中，所述氧化反应所采用的试剂可以包括：TET2酶、TET2反应缓冲液、氧化补充剂、二硫苏糖醇、氧化增强剂、无核酸酶水和Fe(II)。
[0034]在本公开的示例性实施例中，所述氧化反应的反应条件可以包括：反应温度为37℃，反应时间为60min；所述氧化反应结束后加入终止液，并在37℃下孵育30min。
[0035]在本公开的示例性实施例中，所述脱氨基反应所采用的试剂可以包括：APOBEC蛋白、APOBEC反应缓冲液、牛血清蛋白和无核酸酶水。
[0036]在本公开的示例性实施例中，所述脱氨基反应的反应条件可以包括：反应温度为
37℃，反应时间为180min。
[0037]在本公开的示例性实施例中，所述扩增反应所采用的试剂还可以包括：Index Primer Mix和HiFi HotStart Uracil Mix。
[0038]在本公开的示例性实施例中，所述扩增反应的反应条件可以包括：在98℃下反应30s；接着在98℃下反应10s，在62℃下反应30s，在65℃下反应60s，循环7次至16次；在65℃下反应5min；所述扩增反应结束后将反应器的温度维持在4℃。
[0039]在本公开的示例性实施例中，所述构建方法还可以包括纯化处理，所述纯化处理包括以下任意一种或多种：
[0040]在所述延伸反应之后，在所述氧化反应之前，采用磁珠捕获所述延伸反应得到的产物，并采用乙本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种游离DNA甲基化文库构建方法，其特征在于，包括：提供游离DNA样本；将所述游离DNA样本变性为单链DNA；将所述单链DNA与含有胞嘧啶且所述胞嘧啶均有甲基化修饰的接头序列进行连接反应，使所述单链DNA两端各连接一个接头序列，得到两端连接有接头序列的单链DNA；将所述两端连接有接头序列的单链DNA进行延伸反应，所述延伸反应形成延伸片段，所述延伸片段的两端分别与所述两端连接有接头序列的单链DNA两端的接头序列连接，形成两端连接有接头序列的双链DNA；将所述双链DNA中带有甲基化修饰的胞嘧啶进行氧化反应形成受保护胞嘧啶，得到带有受保护胞嘧啶的双链DNA；除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段，得到带有受保护胞嘧啶的单链DNA；将所述带有受保护胞嘧啶的单链DNA中未甲基化修饰的胞嘧啶进行脱氨基反应形成尿嘧啶，得到带有尿嘧啶的DNA；将所述带有尿嘧啶的单链DNA进行扩增反应，得到游离DNA甲基化文库。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述延伸片段中含有至少一个尿嘧啶。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述延伸反应所采用的试剂包括：Klenow反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸的混合液、吐温20水溶液和Klenow Fragment；和/或脱氧核糖核苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸的混合液的工作浓度为0.1mM至0.4mM；在所述吐温20水溶液中，吐温20的质量与水的体积之比为(0.03至0.1)g:100ml；所述Klenow Fragment的工作浓度为0.02U/μL至0.08U/μL；所述延伸反应的反应条件包括：反应温度为20℃，反应时间为15min；所述延伸反应结束后将反应器的温度维持在4℃。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段包括：采用UDG酶进行消化反应，使所述延伸片段中的所述尿嘧啶降解，从而除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段；其中，所述消化反应包括第一消化阶段和第二消化阶段；所述第一消化阶段的反应温度为37℃，反应时间为20min；所述第二消化阶段的反应温度为50℃，反应时间为5min。5.根据权利要求1至4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述接头序列包括第一接头序列和第二接头序列，所述第一接头序列由第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列形成，所述第二接头序列由第三寡核苷酸序列和第四寡核苷酸序列形成，所述第一寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.1所示，所述第二寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.2所示，所述第三寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.3所示，所述第四寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.4所示。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述连接反应所采用的试剂还包括：聚乙二醇水溶液、DNA连接酶缓冲液、二硫苏糖醇、腺嘌呤核苷三磷酸、多核苷酸激酶和DNA
连接酶；和/或，在所述聚乙二醇水溶液中，聚乙二醇的质量与水的体积之比可以为(5至20)g:100ml；所述二硫苏糖醇的工作浓度为0.01M至0.05M；所述腺嘌呤核苷三磷酸的工作浓度为0.5mM至2mM；所述多核苷酸激酶的工作浓度为0.1U/μL至0.4U/μL；所述DNA连接酶的工作浓度为2U/μL至5U/μL；所述连接反应的反应条件包括：反应温度为37℃，反应时间为45min。7.根据权利要求1至4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述受保护胞嘧啶为羧基胞嘧啶；所述氧化反应所采用的试剂包括：TET2酶、TET2...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶邦全，
申请(专利权)人：京东方科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：