提升文库转化率的建库方法技术

本发明专利技术公开了一种提升文库转化率的建库方法，其步骤包括：DNA样品片段化，对片段化后的DNA进行末端削平；纯化产物，添加末端转移酶TdT和核糖核苷酸，在DNA片段3

【技术实现步骤摘要】
提升文库转化率的建库方法


[0001]本申请涉及分子生物学领域，具体涉及一种提升文库转化率的建库方法。

技术介绍

[0002]高通量测序技术(Next generation sequencing,NGS)目前被广泛地应用于诸多领域，如无创产前筛查、新生儿遗传病检测、肿瘤伴随诊断和术后监控、病原微生物检测等。高通量测序分为测序技术和建库技术，测序技术主要由二代测序和三代测序组成，其中二代测序为目前的绝对主流测序技术。这两种测序平台对应的经典建库技术非常类似，通常有如下几个步骤：1)DNA打断；2)末端修复和磷酸化；3)在修复的DNA末端添加“A”碱基；4)接头连接；5)文库扩增；6)文库回收和定量。虽然上述每个步骤都很重要，但是大家最关注的还是文库转化率(library conversion)，即DNA分子两端被接上接头的比例。一些行业内知名的进口建库试剂盒，如KAPA Biosystems的KAPA Hyper Prep和NEB的Ultra II DNAlibrary Prep建库试剂盒宣称其文库转化率可达10％
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50％(DNA投入量越低，转化率越低)。国内NGS建库产品供应商，如翌圣生物和诺唯赞生物经过长期的优化，文库转化率最高可达 60％左右。上述这种经典的建库方法，即在DNA的3
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端各添加一个A碱基(俗称A尾)，接头5
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端多出一个T，依靠T
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A配对连接的方式毕竟有其效率瓶颈，主要是因为A碱基的添加是借助Taq酶的末端转移酶活性来进行，而它的加A性能据称只能达到78％左右(doi: 10.1016/j.jmb.2006.10.008)，很难再有突破性的提升。
[0003]除了T
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A接头连接的方式，有一些工作报道了新型的接头连接方式，比较知名有SwiftBiosciences公司公布的一种平末端连接方案(CN 106459968 B)，它无需对DNA片段进行磷酸化(反而需要去磷酸化)和添加“A”碱基，同时将接头制成平末端，并在其中一端进行双脱氧修饰，防止接头自连。此方案虽然避免了加“A”这个严重影响效率的步骤，但随后的接头连接步骤需要多种酶来实现，大大增加了操作的复杂性和建库时间，不利于大规模操作，而且纯粹的平末端连接方式，连接效率比较低。另一个来自IDT公司的建库专利(CN 110248675A)也公布了一种平末端接头连接方案，不同的是，该方案要求待建库的DNA片段进行磷酸化修饰，为避免DNA片段自连，该方案采用一种T4 DNA连接酶突变体(K159S)。这一突变酶不能利用ATP将底物腺苷酸化，只能连接预腺苷酸化的底物。这一特征可以通过用预腺苷酸化的平末端接头与插入DNA进行连接(接头的互补链用双脱氧修饰进行封闭)，可极大地避免嵌合体的产生。通过这种方式，即避开了严重影响效率的“A”碱基添加步骤，同时只能连接预腺苷酸化的接头，使文库转化率最高可达到90％以上，但该方法只有在建库DNA投入量低于10ng以下时才有优势，对高于10ng以上的建库应用，其建库效率与常规方法无二。而且，碱基的预腺苷酸化和双脱氧修饰修饰非常昂贵，严重限制了该方法的商业化。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种提升文库转化率的建库方法，其特征在于其步骤包括：
[0005](1)DNA样品片段化，对片段化后的DNA进行末端削平；
[0006](2)纯化上述产物，添加末端转移酶TdT和核糖核苷酸，在DNA片段3
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末端添加碱基；
[0007](3)纯化上述产物，将纯化产物与接头进行孵育；
[0008](4)添加DNA聚合酶、DNA连接酶和dNTP，进行缺口平移和接头连接；
[0009](5)纯化上述产物，进行文库扩增，得到DNA文库。
[0010]优选的，所述接头的序列为茎环结构，在接头的3
’
设有2
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4个相同的dNTP，不含barcode 序列。
[0011]优选的，所述接头的序列如表1中所示。
[0012]优选的，步骤(2)中所述核糖核苷酸是rATP、rUTP、rGTP、rCTP中的任一种，且与接头3
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的dNTP互补。
[0013]优选的，步骤(2)中所述核糖核苷酸是rGTP。
[0014]优选的，步骤(1)中进行末端削平的酶是T4 DNA聚合酶或Klenow DNA聚合酶或两者的组合。
[0015]优选的，步骤(4)中所述DNA聚合酶为DNA聚合酶I或Taq DNA聚合酶。
[0016]优选的，步骤(4)中所述的DNA连接酶为E.coli DNA连接酶或Taq DNA连接酶。
[0017]TdT末端转移酶主要被报道用于单链DNA的3
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末端添加碱基。本专利技术是首次将TdT用于双链DNA末端加碱基，并用于双链DNA接头连接。
[0018]现有的建库技术，其中DNA与接头的连接方式，要么是平末端连接，要么是单碱基配对连接。本专利技术利用末端转移酶TdT，以核糖核苷酸为反应底物，在平末端的DNA片段末端插入2
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4个碱基，并设计与之匹配的茎环结构的接头进行连接。本专利技术方法用于配对的碱基个数为2
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4个不等，大大提高了碱基配对的效率。同时，插入片段两端的粘性结构(3
’
端突出碱基)是通过末端转移酶TdT来添加，比传统的Taq DNA聚合酶添加“A”碱基的效率高很多。此外，接头无需进行特殊的修饰、建库DNA无需磷酸化处理，有效降低成本。使用该专利技术方法配制的建库试剂盒对游离DNA(cell
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free DNA,cfDNA)和甲醛固定石蜡包埋DNA(FFPE DNA) 样本进行建库时，明显提升接头连接效率，并极大地提高了文库复杂性、覆盖度和对低频率变体的灵敏度。
[0019]比较本专利技术的建库方法与市售的进口试剂KAPA Hyper DNA建库试剂盒(KAPA Biosystems) 在文库转化率、FFPE和cfDNA深度捕获测序效果的比较。结果显示，不同投入量DNA的文库转化率指标，本专利方法都要优于进口试剂。同时，高深度捕获测序实验结果也显示，本专利方法可获得更高的捕获效率和更高的有效测序深度。
附图说明
[0020]图1.本专利技术方法建库流程示意图。
[0021]图2.末端转移酶TdT在两种rGTP浓度下添加不同“rG”碱基个数的比例。
[0022]图3.末端转移酶TdT以rGTP为底物在DNA的3
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端添加“rG”碱基，会有添加2个、3 个和4个这三种可能，本专利技术使用的颈环接头与三种含“rG”碱基尾巴的DNA结合，存在8 种可能的配对形式。
[0023]图4.实施例1接头测试的所有接头类型示意图，其中Adapter
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C3和Adapter
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G3效果最佳。
[0024]图5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提升文库转化率的建库方法，其特征在于其步骤包括：(1)DNA样品片段化，对片段化后的DNA进行末端补平；(2)纯化上述产物，添加末端转移酶TdT和核糖核苷酸，在DNA片段3
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末端添加碱基；(3)纯化上述产物，将纯化产物与接头进行孵育；(4)添加DNA聚合酶、DNA连接酶和dNTP，进行缺口平移和接头连接；(5)纯化上述产物，进行文库扩增，得到DNA文库。2.根据权利要求1所述的提升文库转化率的建库方法，其特征在于：所述接头的序列为茎环结构，在接头的3
’
设有2
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4个相同的dNTP，不含barcode序列。3.根据权利要求2所述的提升文库转化率的建库方法，其特征在于：所述接头的序列为以下6条序列之一：Adapter
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C2：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCCC；Adapter
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C3：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCCCC；Adapter
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C4：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCCCCC；Adapter

【专利技术属性】
技术研发人员：宋东亮，曹振，罗秉轮，陈晶晶，刘娜，卢瑶，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：